三氧化二砷诱导肝癌细胞系HepG-2自噬及其机制研究
作者：朱传升 侯明 王金慎 王焱 徐文伟 董琳
【摘要】 目的：测定不同浓度三氧化二砷（As2O3）诱导前后HepG-2细胞自噬水平改变，并初步探讨机制。方法：常规细胞培养，按As2O3不同浓度分组；采用MDC染色，荧光显微镜观察自噬囊泡，流式细胞术检测其荧光强度；RT-PCR检测Bcl-2基因转录，免疫组织化学检测细胞Bcl-2蛋白阳性百分率，并分析同自噬的关系。结果：经不同浓度As2O3作用后，HepG-2细胞生长明显受到抑制；荧光显微镜可观察到自噬囊泡的出现；Bcl-2基因表达降低；经相关性分析，HL-60细胞自噬水平与Bcl-2基因表达呈负相关。结论：As2O3可诱导HepG-2细胞自噬，v诱导HepG-2细胞自噬的机制可能与下调Bcl-2基因表达有关，自噬和凋亡存在交叉。
【关键词】 自噬 基因，Bcl-2 三氧化二砷 肝肿瘤 细胞 培养的
Study of HepG-2 cells’ autophagy induced by arsenic trioxide and its mechanism
【ABSTRACT】 Objective: To assess the level of autophagy and its mechanism in HepG-2 cells after induction with arsenic trioxide. Methods: The autophagy was analyzed using fluorescent microscope and flow cytometry by monodansylcadaverin（MDC） staining. RT-PCR was used to examine the Bcl-2 mRNA expression. APAAP was used to detect Bcl-2 protein positive percentage and its correlation with autophagy level was analyzed. Results: HL-60 cells＇ growth was obviously inhibited after induction with different density arsenic trioxide; autophagy vesica was observed using fluorescent microscope; Bcl-2 gene expression was inhibited; cells autophagy level was negative correlated with Bcl-2 gene expression. Conclusion: Arsenic trioxide may induce HpG-2 cells to autophagia and its main mechanism was to down-regulate bcl-2 gene expression.
【KEY WORDS】 Autophagy· Gene，Bcl-2·Arsenic trioxide·Liver neoplasms·Cells, cultured
三氧化二砷（As2O3）作为一种抗肿瘤药物，主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡。关于As2O3是否可诱导肿瘤细胞发生非凋亡形式的死亡（如自噬等），国内外报道较少。本研究通过观察不同浓度As2O3作用HepG-2细胞前后自噬水平的变化，初步探讨了其发生机制，报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 单丹磺酰尸胺（MDC，货号30432）为美国sigma公司产品，临用前用PBS配制成0.05 mmol/L；As2O3 1 g/L（哈尔滨伊达药业产品），用前RPMI 1640稀释成所需浓度；RT-PCR所用TapDNA聚合酶、dNTPs、RNA酶抑制剂等购自上海志壮生物有限公司；目的引物参照说明，由上海生工合成。免疫组化试剂盒、鼠抗人Bcl-2单抗、羊抗小鼠lgG二抗均购自北京中杉金桥生物有限公司。
1.2 细胞培养及分组 肝癌细胞株HepG-2由山东省千佛山普外科中心实验室传代培养。实验细胞以2×105 ml-1 接种于培养瓶中，培养液为10%胎牛血清的RPMI 1640，置37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱，行细胞爬片生长。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度As2O3处理。按As2O3浓度不同分为 0 （对照组）、1.0、 2.0、 4.0 和 8.0 μmol/L 5组；各组于处理24 h后用0.25% 胰蛋白酶消化，收获细胞或取出细胞爬片，进行观察研究。
1.3 一般形态观察 分别于加药前后倒置显微镜观察，并摄片。
1. 4 MDC荧光染色检测自噬 自噬泡（autophagicvacuoles，AV）的染色：文献[1]，取出细胞爬片，PBS洗2次，除去含血清的培养基。用 0.05 mmol／L MDC于37 ℃温育60 min后，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2次，晾干后，使用荧光显微镜（Olympus）加356 nm发射滤片和545 nm断滤片进行观察和摄片。
1.5 自噬的流式细胞术定量分析 以上述MDC染色方法染色，用Elite流式细胞仪（COULTER公司，USA）以488 nm激发波长，测定MDC染色的荧光强度。将光散射及荧光数据输入机分析得出结果。1.6 RT-PCR检测Bcl-2 mRNA表达 37 ℃、饱和湿度、5%CO2 培养箱培养24 h后，收集细胞，PBS洗2次。采用异硫氰酸胍一步法提取RNA，260/280 nm测定其浓度和纯度；RT-PCR步骤参照逆转录酶试剂盒说明。Bcl-2引物序列: Sense 5’￣TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG￣3’， Antisense 5’￣TCACTTGTGGCTCAGATAGG￣3’，片段280 bp；β￣action引物序列：Sense 5’￣GGGTCAGAAGGATTCCTGTG￣3’，Antisense 5’￣GGTCTCAAACATGATCTGGG￣3’，片段317 bp。PCR 产物各20 μl,在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭染色,并在紫外灯下显影拍照。
1.7 免疫组化法检测细胞Bcl-2蛋白阳性率 采用APAAP法，具体染色步骤参照试剂盒说明。阳性结果为胞质内出现红色颗粒，油镜下计数100个细胞，并计算阳性细胞百分率。每组实验重复3次，以3次结果的均值为最后结果。
1.8 统计学处理 采用SPSS10.0软件包进行统计学分析。数据以x±s表示；两样本均数之间的比较，采用t检验。相关性分析采用Pearson直线相关分析。α=0.05为显著性检验标准。
2 结果
2.1 As2O3对HepG-2细胞生长的影响 倒置显微镜观察对照组细胞数目较多，细胞伸展良好，胞质均匀透明。经As2O3作用24 h后，与对照组比较，各组细胞数目明显减少，部分细胞贴壁能力下降，呈飘浮生长状态，细胞形态逐渐变圆，体积变小（图1）。
2.2 HepG-2细胞自噬水平改变 MDC可被HepG2细胞吸收并选择性地聚集于自噬囊泡中，荧光显微镜观察时染上MDC荧光的AV呈深绿色或黄绿色点状结构，多散布于核周。对照组细胞，仅见到很少量的MDC阳性细胞，并且每个细胞中含的AV数量很少；而在各As2O3处理组，MDC阳性细胞数明显增加，每个细胞中AV数量也较多（图2）。流式细胞术定量测定MDC阳性细胞百分率随As2O3浓度增加而递增，与对照组比较，差异有统计学意义，P＜0.05（表1，图3）。
2.3 As2O3对Bcl-2基因转录水平及Bcl-2蛋白表达影响 经不同浓度As2O3作用24 h后，各组Bcl-2基因表达较对照组均明显减弱，且与As2O3浓度有关（图4）。对照组及各处理组均可检测到Bcl-2蛋白表达，阳性结果为胞质内出现红色颗粒（图5）。各处理组平均Bcl-2蛋白阳性细胞数随As2O3浓度上升而下降,与对照组比较，差异有统计学意义，P＜0.05，见表1。
2.4 细胞自噬同Bcl-2基因表达的关系 经相关性分析，细胞自噬水平与Bcl-2蛋白阳性细胞数呈负相关（r=-0.47, P＜0.05）。
３ 讨论
几十年以来，凋亡一直作为细胞程序性死亡的主要和唯一机制。证据表明，化疗不仅可引起肿瘤细胞凋亡，还可引起其他形式的非凋亡形式死亡如坏死、自噬、有丝分裂突变以及细胞衰老等[2]。Clarke[3]将细胞死亡分为：（1）凋亡性程序性细胞死亡；（2）自噬性程序性细胞死亡；（3）非溶酶体降解；（4）细胞质型降解。自噬作为细胞死亡的一种新的形式，越来越引起人们的重视。
砷剂是我国首先发现的抗白血病药物，２０世纪70年代开始应用于临床，近年来用于多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和各种实体瘤。但其抗肿瘤机制尚不清楚，大多数观点认为与其诱导凋亡有关。关于As2O3是否可诱导细胞自噬，国内外报道较少。单丹磺酰尸胺（MDC）是一种特殊染料，可被细胞吸收并与自噬囊胞特异结合，可在荧光显微镜下呈现绿色或黄绿色荧光，是一种定量检查自噬的特异性方法。本研究利用MDC这种染料，参照[1]方法，发现经As2O3作用后，HepG-2细胞生长明显受到抑制，而自噬水平显著升高，有浓度依赖性。这与国外报道相似，如Kanzawa 等[4]观察到小剂量As2O3（≤2 μmol/L）可显著抑制6种胶质瘤细胞系的增殖，使胶质瘤细胞停止在G2/M期，呈浓度依赖性；电镜观察到自噬，而不是凋亡。半胱天冬酶抑制剂不能抑制As2O3诱导的细胞死亡。
Bcl-2是一种凋亡抑制基因，通常认为它主要抑制线粒体通透蛋白（permeability transition protein，PTP）开放并维持线粒体膜电位，抑制细胞色素C和酸性同功铁蛋白（acidic isoferritin，AIF）从线粒体释放入胞质，从而抑制凋亡[5，6]。本研究用RT-PCR和免疫组织化学分别在基因转录水平和蛋白水平检测了Bcl-2表达，发现经As2O3作用后，Bcl-2表达明显下调，且与HepG-2自噬水平呈负相关，提示Bcl-2的表达调控可能与细胞自噬存在一定的关系。SaekiK等[7]用Bcl-2基因全长的反义mRNA寡核苷酸序列株转染HL-60细胞后，细胞生长明显受到抑制，并且出现了大量的细胞死亡，电镜显示细胞死于自噬，细胞形态和线粒体并无明显变化。既无线粒体膜电位的下降，也无AIF的核转录。半胱天冬酶抑制剂不能阻断Bcl-2 mRNA下调诱导的自噬。Pattingre等[8]研究发现，Bcl-2与目前证实的自噬调控基因Beclin 1作用相反，认为Bcl-2作为一种致癌基因可能同时抑制了自噬和凋亡。Shimizu [9]等认为Bcl-2家族蛋白不仅调控凋亡，而且可以调节自噬基因依赖的非凋亡形式的其他类型的程序性细胞死亡。
总之，As2O3诱导HepG-2细胞发生非凋亡性细胞死亡自噬，可能成为一种新的抗肿瘤途径。As2O3诱导HepG-2细胞自噬的机制可能与下调凋亡抑制基因Bcl-2表达有关，自噬和凋亡可能在某些环节存在交叉。
【文献】
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