肉苁蓉对败血症休克大鼠胸腺细胞凋亡的影响
【摘要】 目的 探讨肉苁蓉提取物对败血症休克大鼠胸腺细胞凋亡的影响及其机制。方法 60只大鼠随机分为实验组、空白对照组和对照组，各20只，空白对照组分离盲肠后不做结扎、穿孔处理，实验组及对照组行盲肠结扎穿孔术（CLP）建立大鼠败血症休克模型。术前14日开始实验组给予肉苁蓉溶液1.25 g/kg，对照组及空白对照组给予等量0.9%氯化钠注射液。于术后12、24 h取材。流式细胞仪检测各组胸腺细胞凋亡率和线粒体膜电位，分光光度法测定细胞SOD活性、MDA含量。结果 实验组CLP术后12、24 h胸腺细胞凋亡率均低于对照组（P<0.01），线粒体膜电位显著上升（P<0.01），细胞超氧化物转化酶(SOD)活性上升、丙二醛(MDA)含量下降与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。结论 肉苁蓉提取物对败血症休克时胸腺细胞有保护作用，其机制可能是提高SOD活性，降低MDA含量，清除自由基反应，维持了细胞线粒体膜电位。
【关键词】 肉苁蓉 出血性败血症 细胞调亡 线粒体 超氧化物歧化酶 丙二醛 动物 实验
Effect of Roucongrong on thymus cell apoptosis in rats with septicaemia
【Abstract】 Objective To observe the effect and mechanism of extract of Roucongrong on thymus cell apoptosis in rats with septicaemia. Methods 60 rats were randomly divided into experimental group, blank control group and control group, 20 rats in each group. The rats in blank control group were not treated by ligation and perforation after cecum separation, while the rats in experimental group and control group were performed by cecum ligation perforation (CLP) to set up rat model with shock caused by septicaemia. The rats in three groups were treated by correspondent drugs 14 days before ligation (1.25 g/kg), and the specimens were taken at 12 h and 24 h after the operation. The apoptotic rates and potential of mitochondrial membrane were detected by flow cytometer and the activity of SOD and content of MDA were determined by spectrophotometry. Results The thymus cell apoptotic rate at 12 h and 24 h after the CLP operation in experimental group was significantly lower than that of control group(P<0.01），however, the potential of mitochondrial membrane was significantly increased (P<0.01）; the activity of SOD was increased, while the content of MDA was decreased，as compared with those of control group（P<0.01）. Conclusion The extract of Roucongrong has protective effect on thymus cell in rats with shock due to septicaemia, its mechanism might be related with the increase of activity of SOD, decrease of content of MDA, reaction of free radical scavenging and steady of potential of mitochondrial membrane.
【Key words】 Roucongrong; Septicaemia; Thymus cells; Chondriosome
败血症休克是临床上常见的危重病症，病死率居高不下。在其病理损伤中，胸腺细胞凋亡的作用日益受到重视。T淋巴细胞的过早凋亡，是引起机体免疫抑制的主要原因之一。本实验探讨了肉苁蓉对盲肠结扎穿孔术（CLP）诱导的败血症休克大鼠模型中胸腺细胞凋亡率及细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠60只，体质量180～200 g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供（动物合格证号：0035457）。
1.1.2 试剂与仪器 Annexin-v及PI双标试剂盒由Immunotech公司生产，SOD活性和MDA含量测定试剂盒由南京建成生物研究所提供，Rhodamine123为Sigma公司产品，其他试剂均为国产分析纯。流式细胞仪型号：EPICS，Beckman Coulter公司生产。
1.2 实验方法
1.2.1 药品制备 肉苁蓉20 g水煎3次，煎液合并，浓缩,加入一定量乙醇，静置24 h后过滤，滤液放置至无乙醇味，加蒸馏水配成每mL含生药1 g的溶液。
1.2.2 模型制备 实验组和对照组采用CLP术诱导败血症动物模型的建立，具体参照［1］进行。空白对照组分离出盲肠后既不结扎也不穿孔。
1.2.3 动物分组与给药方法 60只大鼠随机分为实验组、对照组和空白对照组，各20只。术前14日开始，实验组予肉苁蓉溶液灌胃，1.25 g/kg体质量,对照组及空白对照组予等量0.9%氯化钠注射液，均每日1次。各组动物均于术后12、24 h各处死10只。
1.3 观察指标
1.3.1 HE染色和透射电镜观察 处死动物后，取部分胸腺，常规石蜡切片，HE染色，光镜观察并拍照；常规电镜制片，透射电镜下观察细胞线粒体形态学改变。
1.3.2 胸腺细胞凋亡百分率 处死动物后，常规消毒，迅速分离胸腺，无菌纱布拭净残血，取部分胸腺制作胸腺细胞悬液，调整细胞浓度至（2～5）×106/L，光镜下计数。应用Annexin-v及PI双标试剂盒检测10 000个细胞，记录位于凋亡区内的细胞数量，出凋亡细胞的百分率。凋亡细胞百分率=(凋亡区内细胞数/1000)×100%。
1.3.3 氨基酸(DNA)断裂百分率 取300 μL胸腺细胞悬液与等量低张细胞膜裂解缓冲液混匀，致细胞膜破裂（核膜未破），13 000 r/min离心10 min，将上清液倒入另一支试管，按Burton［2］的方法（二苯胺法）测定。DNA断裂百分率=［上清液DNA含量/（上清液DNA含量+沉淀DNA含量）］×100%。
1.3.4 线粒体膜电位测定 取胸腺细胞(约2×106个)悬液，磷酸缓冲液（PBS）洗3次，将细胞重悬于0.5 mL PBS中，取储存于-20℃溶于二甲基亚枫（DMSO）的Rhodamine123储存液（1 mg/mL），加入到上述细胞悬液中，至终浓度为10 mg/L，避光，37℃染色30 min，立即用流式细胞仪分析。
1.3.5 SOD活性、MDA含量测定 处死动物后，取部分胸腺，置于玻璃培养皿中，用眼科剪剪碎，加入匀浆介质，用玻璃匀浆器手工匀浆，制成10%的组织匀浆。测定SOD活性、MDA含量。
1.4 统计学处理 实验数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较应用t检验。
2 结果
2.1 HE染色和透射电镜观察 术后12 h 3组胸腺均无明显病理改变，胸腺细胞密集分布于胸腺皮质，细胞核呈圆形，深蓝色着染，胞质少；超微结构观察线粒体，实验组及对照组可见线粒体嵴肿胀现象。术后24 h对照组动物胸腺皮质区细胞成分稀疏，淋巴细胞减少，巨噬细胞增多，局部可见灶状坏死及散在的细胞碎片；线粒体嵴肿胀明显，可观察到空化现象出现。实验组动物胸腺细胞碎片较少，线粒体嵴肿胀现象明显减轻。空白对照组胸腺无明显变化。
2.2 各组胸腺细胞凋亡百分率和DNA断裂百分率比较 见表1。
表1 各组胸腺细胞凋亡百分率和DNA断裂百分率比较（略）
与空白对照组比较，*P<0.01；与对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01
由表1可知，实验组及对照组CLP术后12 h胸腺细胞凋亡即显著增加，24 h更加明显（P<0.01），但实验组CLP术后12 h及24 h细胞凋亡百分率及DNA断裂百分率与对照组相应时间比较差异均有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。
2.3 各组术后线粒体膜电位 见图1。
图1 各组术后线粒体膜电位（略）
细胞经Rhodamine123染色，流式细胞仪检测，固定一标尺可分为两群细胞：荧光强度低(△Ψmlow)的和荧光强度高(△Ψmhigh)的细胞。由图1可见，CLP术后12 h荧光强度低的细胞显著增多，对照组为(16.66±1.48)%,实验组为(10.32±1.54)%，2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；术后24 h 对照组为（32.46±1.4）%，实验组为(20.4±0.44)%，2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.4 各组术后胸腺组织SOD活性和MDA含量比较 见表2。
表2 各组术后胸腺组织SOD活性和MDA含量比较（略）
与空白对照组比较，*P<0.01,与对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01
由表2可见，与对照组比较，实验组显著地提高了CLP术后12、24 h胸腺组织SOD活性，降低了胸腺组织MDA浓度，2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。
3 讨论
败血症休克的发病机制十分复杂，其中氧自由基起着重要作用。脓毒血症时，大量氧自由基释放形成细胞内活性氧（ROS）的堆积，ROS具有很高的生物活性，极易与生物大分子反应，直接损害或通过一系列过氧化链式反应引起广泛的生物结构的破坏。细胞内虽有一系列的抗氧化防御机制，但在脓毒血症时，机体的抗氧化能力明显下降，氧化和抗氧化作用失衡，细胞凋亡可能是这种失衡的结果之一。许多能诱导细胞凋亡的理化因素也能导致大量自由基的生成。多种细胞暴露于低剂量的H2O2就可被诱导凋亡，直接证实了自由基可作为细胞凋亡的介质［3］。本实验中CLP术后12、24 h胸腺组织SOD活性显著降低，MDA浓度升高，表明脂质过氧化反应加强，此时光镜下见细胞稀疏，坏死增多；流式细胞仪检测细胞凋亡明显升高。
实验表明氧自由基灭活剂可保护内毒素或CLP术诱导的胸腺细胞凋亡［4，5］。肉苁蓉是我国稀有的名贵中草药，药研究表明其中所含的肉苁蓉多糖（CDPS）、D-甘露醇均能有效地清除自由基［6，7］。本实验研究发现，实验组在CLP术后24 h光镜下的胸腺组织细胞坏死明显减少，“皮髓倒置”现象得到明显改善；流式细胞仪检测细胞凋亡显著减少；胸腺组织SOD活性升高，MDA含量下降，提示肉苁蓉可能是通过清除自由基的反应来有效的保护败血症大鼠胸腺细胞。
近年来细胞凋亡机制研究的一项重大突破就是对线粒体重要性的认识，大量实验证实许多因素诱导的细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱［8］，并认为线粒体潜力减少构成在体淋巴细胞凋亡早期不可逆步骤。线粒体还是ROS的主要来源和促凋亡作用靶点。Rhodamine123是一种亲脂性阳离子荧光染料，其荧光信号主要集中于线粒体，荧光强度的变化反映了线粒体膜电位的变化。本实验研究发现肉苁蓉提取物显著地抑制CLP术后12、24 h胸腺细胞线粒体膜电位的下降。在大多数情况下，线粒体膜电位的降低［9］，表明线粒体膜通透性转运孔（MPTP）的开放。MPTP的开放导致线粒体释放caspase活化物，活化caspase，引起细胞凋亡。因此，保持线粒体膜电位可能也是肉苁蓉降低胸腺细胞凋亡率的机制之一。
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