VEGFR?3在胃癌细胞中表达的意义
作者：张明仪,吴建农,张建新,陈吉祥,张清,谢嵘
【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子受体（VEGFR?3）在胃癌细胞中表达的意义，探讨肿瘤淋巴管生成的分子生物学机制。方法 选择早期胃癌13例；进展期胃癌87例，其中无区域淋巴结转移者37例，有区域淋巴结转移者50例；选择正常胃粘膜10例设为对照组。应用免疫组织化学Envision TM两步法,检测正常胃粘膜和胃癌标本VEGF?C、VEGF?D、胃癌细胞中VEGFR?3、淋巴管内皮细胞VEGFR?3和细胞间粘附分子?1（ICAM?1）的表达。结果 （1） VEGFR?3在对照组、早期胃癌组和进展期胃癌组中阳性表达率分别为30%、54%和68%，进展期胃癌组与对照组比较明显升高（P＜0.01）。（2） VEGF?C阳性表达与胃癌细胞VEGFR?3阳性表达有高度一致性（P＜0.01）。肿瘤淋巴管计数在胃癌细胞VEGFR?3表达阳性组与阴性组中差异有显著性（P＜1.20 E?13），进展期胃癌肿瘤淋巴管计数在胃癌细胞VEGFR?3表达阳性组与阴性组中差异有显著性（P＜1.63 E?07）；其他各项指标在胃癌细胞VEGFR?3表达阳性与阴性组中差异无显著性。（3） Logistic回归分析显示胃癌细胞VEGFR?3阳性表达与VEGF?C阳性表达和肿瘤淋巴管计数相关程度高。结论 胃癌细胞中存在VEGFR?3高表达；胃癌细胞分泌的VEGF?C和VEGFR?3也可诱导肿瘤淋巴管生成。
【关键词】 胃癌; VEGFR?3; 淋巴管生成
Abstract：Objective To study significance of expression of VEGFR?3(vascular endothelial growth factor recepter?3) in gastric cancer cells and to explore molecular biologic mechanism of lymphangiogenesis in gastric cancer.Methods Subjects investigated were 13 cases of early stage of gastric cancer and 87 cases of advanced gastric cancer,including 37 of 87 cases without regional lymphatic metastasis and 50 of 87 cases with regional lymphatic metastasis; meanwhile,10 cases of normal gastric mucosa as control group.Expression of VEGF?C,VEGF?D,VEGFR?3 and ICAM?1 were studied in all subjects investigated with two?step system of immunohistochemistric Envision TM.Results (1) The normal gastric mucosa and tumor cells in early stage of and advanced gastric cancer could express VEGFR?3,the positive rates of expression were ３０％,54％ and 68％ in the normal gastric mucosa,early stage of and advanced gastric cancer,respectively.There was a significant difference in expression of VEGFR?3 between advanced gastric cancer and normal gastric mucosa samples (P＜0.01).(2) There was a statistical correlation between expression of VEGF?C and VEGFR?3 in tumor cells in gastric cancer (P＜0.01).The lymphatic micro vessel density (LMVD) was a significant difference between group of positive expression of VEGFR?3 and group of negative expression of VEGFR?3 in tumor cells of gastric cancer and advanced gastric cancer（P＜1.20 E?13,P＜1.63 E?07.(3) With Logistic Regression Analysis,positive expression of VEGFR?3 in tumor cells of gastric cancer was close relationship with positive expression of VEGF?C in tumor cells of gastric cancer and positive expression of VEGFR?3 in lymphatic endothelial cells of gastric cancer and advanced gastric cancer.Conclusion Our results suggest that VEGFR?3 also expresses in the tumor cells in gastric cancer; VEGF?C and VEGFR?3 in the tumor cells of gastric cancer are more likely to induce the lymphangiogenesis.
Key words：Gastric neoplasm;EGFR?3;Lymphangiogenesis
0引言
VEGFR?3(Vascular endothelial growth factor receper?3)是VEGF?C,D(Vascular endothelial growth factor C ?D )的受体，与其结合共同调节淋巴管的生成和增殖。作者在研究VEGFR?3在胃癌淋巴道转移的实验中意外发现VEGFR?3在胃癌细胞中也有相当数量的表达。于是，对VEGFR?3在胃癌细胞中的表达作了初步的研究。本实验的目的在考察胃癌细胞中表达的VEGFR?3与VEGF?C、D，淋巴管内皮细胞表达的VEGFR?3、细胞间粘附分子?1（ICAM?1）和临床病理参数的关系，由此初步揭示VEGFR?3在胃癌细胞中表达的意义。
1 材料和方法
1.1研究对象
早期胃癌组13例，无区域淋巴结转移，男8例，女5例；年龄50～71岁，平均年龄61.33±6.97岁。进展期胃癌组87例，其中无区域淋巴结转移者37例，有区域淋巴结转移者50例，男61例，女26例；年龄31～82岁，60.16±10.64岁。用正常胃粘膜10例为对照组。
1.2实验方法和试剂
兔抗人VEGF?C、VEGF?D、VEGFR?3多克隆抗体，小鼠单克隆抗体CD54购自美国SANTA CRUZ公司，EnVisionTM试剂盒，购自DAKO公司。免疫组化采用EnVisionTM两步法。具体步骤参照说明书。PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3结果判断
VEGFR?3在胃癌细胞中的表达定位于细胞浆，阳性染色为棕黄色。ICAM?1表达在胃癌细胞的胞膜和胞浆，阳性染色棕黄色。VEGF?C、D表达在胃癌细胞的胞浆，阳性染色棕黄色。采用AB值法判定免疫组化结果。A:按显色评分。显色细胞占实质细胞总数的1/3以下为1分,1/3～2/3阳性显色细胞为2分,2/3以上阳性显色细胞为3分。B:按切片中细胞显色评分。0分为无着色,1分浅黄色,2分棕黄色,3分棕褐色。AB值法积分:阴性(-) :0分;弱阳性(+) :1～3分;阳性(++) :4～6分;强阳性(+++) :大于6分，见图1、2。
肿瘤淋巴管计数：肿瘤淋巴管VEGFR?3阳性染色为棕黄色，位于肿瘤组织间质，多呈裂隙状，内无红细胞。先于低倍视野下确定3个淋巴管密集区域，然后在100倍放大视野下记数，取3个区域100倍视野下淋巴管平均数作为肿瘤新生淋巴管密度（Lymphatic Microvessel Density，LMVD），见图3、4。
胃癌术后标本石蜡切片，HE染色下观察淋巴管、脉管受侵情况。见扁平内皮细胞构成的管腔，内有淋巴液、淋巴细胞，管腔内有癌栓形成，定为淋巴管受侵；见扁平内皮细胞构成的管腔，内有红细胞，管腔内有癌栓形成，定为脉管受侵。
1．4统计学处理
计数资料用χ2检验和校正χ2检验。计量资料用t检验。相关多因素分析用Logistic回归分析，用SAS 8.2统计软件。
2结果
2.1VEGFR?3在胃癌细胞中的表达
VEGFR?3在正常对照组、早期胃癌组和进展期胃癌组中阳性表达率分别是３０％（3/10）、54％（7/13）和68％（59/87），早期胃癌和进展期胃癌VEGFR?3阳性表达率皆有升高；进展期胃癌组与对照组比较，VEGFR?3阳性表达率明显升高（P＜０.01）；早期胃癌与对照组比较，VEGFR?3阳性表达率差异无显著性（P＞0.01）；早期胃癌组和进展期胃癌组VEGFR?3阳性表达率比较，差异无显著性（P＞0.01），见表1。表1 VEGFR?3在胃癌中的表达（略）
2.2胃癌细胞VEGFR?3表达与临床病理参数和其他相关蛋白表达的关系
VEGF?C阳性表达与胃癌细胞VEGFR?3阳性表达有高度一致性（P＜0.01）。肿瘤淋巴管计数（VEGFR?3在淋巴管内皮细胞表达）在胃癌细胞VEGFR?3表达阳性与阴性组中差异有显著性（P＜1.20 E?13）。进一步分析发现进展期胃癌肿瘤淋巴管计数在胃癌细胞VEGFR?3表达阳性与阴性组中差异有显著性（P＜1.63 E?07）。其他各项指标在胃癌细胞VEGFR?3表达阳性与阴性组中差异无显著性，见表2。表2 胃癌细胞VEGFR?3表达与临床病理参数和其相关蛋白表达的关系（略）注：NS表示无统计学差异2．3VEGFR?3在胃癌细胞中表达与相关参数的Logistic回归分析结果
设VEGFR?3在胃癌细胞中阴阳性表达数为应变量，其余临床病理参数和其他相关蛋白表达为自变量，进行Logistic回归分析。结果表明，VEGFR?3在胃癌细胞中表达与VEGF?C表达和肿瘤淋巴管计数（VEGFR?3在淋巴管内皮细胞表达，未分期和进展期）相关程度高，见表3。表3 胃癌细胞中表达VEGFR?3与相关参数的Logistic回归分析结果（略）
3讨论
VEGFR?3是淋巴管生成因子VEGF?C、VEGF?D的受体，主要表达在淋巴管，有学者报道VEGFR?3可表达于白血病细胞和鼠肝癌细胞及转移性腺癌 [1?3]。VEGFR?3是受体酪氨酸蛋白激酶,是细胞信号传导通路之一；其生理功能是淋巴管正常功能维持所必须的,对细胞生长和不同生理反应有重要作用。本实验结果发现对照组VEGFR?3阳性表达率为３０％；其生物学意义是维持淋巴管正常功能。胃癌细胞VEGFR?3阳性表达率在早期胃癌和进展期胃癌皆升高，但进展期胃癌中升高有显著性差异（P＜０.01）；以前的研究发现 VEGFR?3仅在胃癌组织中的淋巴管内皮细胞和部分小血管内皮细胞有表达，但本研究发现在胃癌细胞也有VEGFR?3的阳性表达，随胃癌病程进展胃癌细胞中的VEGFR?3的阳性表达率升高。有学者报道在其他肿瘤细胞中有VEGFR?3的阳性表达[1?3 ]。说明VEGFR?3除在淋巴内皮细胞表达外，也可在肿瘤细胞内表达。本实验结果也证明了同样的结论。
Skobe M 等通过动物模型第一次直接证明肿瘤细胞可以通过分泌淋巴管生成诱导因子VEGF?C、D诱导肿瘤组织的外周或者内部的淋巴管生成[4?6]。也就是说恶性肿瘤内部存在新生淋巴管,VEGF?C 是通过激活其位于淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR?3 促进肿瘤内淋巴管的生成 [4，7，8] 。本实验结果发现胃癌细胞VEGFR?3阳性表达与VEGF?C阳性表达有高度一致性，进一步用Logistic回归分析也证明胃癌细胞VEGFR?3阳性表达与VEGF?C阳性表达有高度相关性。在胃癌细胞 (下转第38页)表达VEGFR?3阳性组的肿瘤淋巴管计数比阴性组高（P＜1.20E?13)；Logistic回归分析也发现胃癌细胞VEGFR?3阳性表达与肿瘤淋巴管计数高度相关，进一步分析进展期胃癌细胞VEGFR?3阳性表达与肿瘤淋巴管计数相关程度更高。以上实验结果分析初步揭示了胃癌细胞中VEGF?C、VEGFR?3和肿瘤淋巴管计数三者之间的关系。
已发现肿瘤内分泌的VEGF?C与淋巴内皮细胞表达的VEGFR?3结合能刺激肿瘤淋巴管生成[4，7，8]；本实验发现胃癌细胞内的VEGFR?3与VEGF?C结合也能刺激肿瘤淋巴管生成，这又多了一条刺激淋巴管生成的通路。此发现可能更好的解释肿瘤内淋巴管最初生成的机制。由此可知胃癌组织内淋巴管生成也可通过胃癌细胞内的VEGFR?3与VEGF?C结合刺激肿瘤内淋巴管生成。所以，胃癌组织中的肿瘤淋巴管形成可能有两条途径：（1）胃癌细胞分泌的VEGF?C，D与淋巴管内皮细胞表达的VEGFR?3结合，刺激和诱导肿瘤淋巴管形成。这在以前有报道。（2）胃癌细胞分泌的VEGF?C与胃癌细胞分泌的VEGFR?3结合也可刺激和诱导肿瘤淋巴管形成。
【】
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