吡柔比星与温热协同对胃癌组织的体外作用
【摘要】 目的 比较吡柔比星（Pirarubicin，THP）和其他化疗药物对胃癌组织温热协同的作用，探讨化疗药物与温热化疗的协同作用机制。方法 利用36个病例的手术切除胃癌组织，建立人胃癌组织体外立体培养作用模型,MTS?PMS比色法检测组织培养物活性以了解化疗药物以及温热化疗的抑瘤效果。TUNEL荧光检测原位细胞凋亡,HE染色研究评价药物对胃癌组织在组织形态学上的改变并进行电镜观察。结果 DDP、MMC和THP对胃癌组织的杀伤均具有较强的温热协同关系（P=0.000）,THP单独处理和温热协同处理均具有较强的抑制作用，和其他3种药物抑制率比较具有显著性差异（P<0.05）。THP和温热协同处理效果和胃癌病例组织学分级有关（P=0.000），而与年龄、性别、肿瘤大小、临床分期和术前CEA水平无关（P>0.05）。THP温热协同处理凋亡指数和其他3种药物比较具有显著性差异（P<0.05）。HE染色表明，THP和温热处理后，胃癌组织大部崩解，细胞变性坏死。电镜分析表明经THP和温热协同处理后细胞胞膜内陷，胞浆空泡化，并出现染色质浓聚，同时核膜消失。结论 THP对胃癌组织具有良好的温热协同效应和肿瘤杀伤效果,具有进一步临床研究价值。
【关键词】 吡柔比星；温热效应； 胃癌
Chemotherapy Effects of Pirarubicin in Combination with Hyperthermia on Gastric Cancer Tissues in Vitro
Abstract：Objective Comparison of the effects of pirarubicin (THP) in combination with hyperthermia on gastric cancer tissues in vitro and to discuss the underlying mechanisms.Methods In vitro three?dimensional acting models were established with tissue biopsies from 36 patients with pathologically confirmed gastric cancer.Tumor cell viability was measured by MTS?PMS assay.TUNEL fluorescence detection in situ apoptosis,HE staining was used to study histomorphology of drug treated gastric tissues.Electron microscope observed cells.Results Synergistic effects were observed after tumor tissues were treated with hyperthermia and three drugs including cisplatin,THP,and mitomycin (P=0.000),while THP exhibited superior cytotoxic effects to other drugs on cancer tissues.Furthermore,histomorphological studies suggested strong killing effects of THP on cancer tissues,including disrupted tissue structure,cellular degradation and necrosis,karyopyknosis and karyolysis,also with loss of cytoplasm.Anti?tumoral effects of THP were associated with pathological grading(P=0.000),while irrelated to patients' gender,age,tumor size，clinical staging and preoperative CEA levels(P>0.05).The apoptosis index has significant difference compared THP and the other three drugs.After treated by THP,the gastric tissues disaggregation,and electron microscope observed cell membrane invagination,endochylema vacuolization.Nuclear membrane diaappeared.Conclusion Synergistic effects of pirarubicin in combination with hyperthermia were evident; cytotoxicity of pirarubicin was thermally enhanced considerably by mild hyperthermia on gastric cancer tissue.THP may be a potential therapeutic drug for intra?peritoneal chemohyperthermia.
Key words：Pirarubicin; Hyperthermia; Gastric Cancer
0 引言
消化道恶性肿瘤是临床最常见的恶性肿瘤，目前手术切除仍是消化道肿瘤的首选方法，但对进展期胃肠道恶性肿瘤，根治手术后仍有较高的复发率。术中腹腔内温热灌注化疗(Itraoperative peritoneal hyperthermia chemotherapy,IPHC)直接作用于上述复发和转移部位，对预防胃肠道恶性肿瘤根治术后复发有一定作用，且副作用小，是近年来国内外研究的热点之一。然而，对于浸润腹膜下较深的肿瘤，HIPEC化疗后仍有腹膜复发。因此，研究和应用穿透性好的药物，提高药物穿透能力，增强热的渗透效应将是今后的研究方向。本研究拟建立胃癌组织小块三维培养技术，研究吡柔比星（Pirarubicin，THP）对胃癌组织的温热协同效应和作用机制。
1材料和方法
1.1胃癌标本2004～2005年本院行根治性胃大部切除或胃全切的胃癌手术标本36例，均经病明确诊断。其中，男22例，女14例，年龄33～85岁，平均60.7岁。患者临床分期、病理组织学分类、术前CEA水平和肿瘤直径资料，见表1。表1 胃癌病例背景资料和THP温热抑制率（略）
1.2化疗药物
顺铂(DDP)购自齐鲁制药厂，吡柔比星(THP)由深圳万乐医药有限公司提供，丝裂霉素（MMC）为日本协和发酵产品，氟尿嘧啶注射液（5?Fu）为浙江海普制药公司产品。药物储存液根据说明书进行配制,储存于-20℃冰箱。
1.3试剂和耗材无酚红RPMI 1640和胎牛血清为Hyclone公司产品；MTS购自Promega公司; 硫酸酚嗪甲酯(Phenazine methosulfate,PMS)、DMSO、新霉素和两性霉素B均为Sigma公司产品；胶原蛋白海绵为北京益而康生物技术有限公司产品，规格为10×1.5×0.1，海绵使用前剪成0.5cm大小；24孔培养板为Costar产品。
1.4温热效应研究根据Hoffman[1]等方法，手术标本剥离表面的脂肪和纤维组织，用PBS清洗其表面的血污和脏物，然后将标本置于含有抗生素的浸泡液（新霉素50μg/ml，两性霉素5μg/ml）中浸泡15min。再加入1640培养液进行洗涤，用手术刀将标本尽量切割成1mm大小的小块，3块组织块加入胶原海绵上，然后转移至已预加培养基0.6ml的24孔板孔中，培养箱37℃培养过夜。第二天每孔沿孔壁缓慢加入含有药物的培养基0.4 ml，每个药物浓度3个平行孔，于42℃作用1h，然后吸出药物，培养基洗2次，加入新鲜培养液1ml继续培养3d。目前THP在温热化疗方面的应用报道甚少,本研究其静脉用药剂量(40mg/m2),浓度设定为32μg/ml。其他药物浓度参考报道[1]，其中，DDP处理浓度为50μg/ml，MMC浓度为15μg/ml，氟尿嘧啶为350μg/ml。
1.5MTS?PMS比色法 MTS的配制
以DPBS配制成2mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌，分装。 PMS的配制：以PBS配制成100mmol/L的贮存液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。MTS?PMS使用液：在新配制的MTS（2mg/ml）中以20∶1体积比加入PMS混和即用。MTS?PMS测定方法：24孔培养板每孔加入100μl的MTS?PMS使用液，继续培养4h后，振荡10min，每孔取100μl，以490nm的波长测定吸光度值（OD490），取三个平行孔均值。
抑制率(%)＝(加药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD) ×100
1.6TUNEL荧光检测原位细胞凋亡药物处理后的组织小块置于恒冷箱冰冻切片机切片架上，待组织块冷冻变硬后切片，厚度为5～7μm。4％多聚甲醛中4℃固定30min，用0.1% TritonX?100冰上穿透5min，PBS洗涤3次，共15min。加入FITC标记的TUNEl反应混合物，37℃湿盒反应90min，然后用PBS洗涤3次，共30min,80%磷酸甘油封片。取非坏死区荧光显微镜观察计数200个以上细胞，作阳性率统计（凋亡指数，AI）。
1.7组织和细胞形态学研究
药物处理后的组织小块置于10%中性甲醛中4℃固定48h，经系列乙醇脱水，石蜡包埋后切片。切片经苏木素和伊红染色，显微镜下观察温热化疗前后肿瘤组织形态学变化；用于电镜分析的标本采用2%戊二醛固定，然后依次经四氧化硪处理和梯度脱水后，包埋并切片镜检。
1.8统计学分析
采用SPSS 10.0统计分析软件。化疗药物温热协同作用与单独化疗药物两组比较采用配对t检验；各个化疗药物间作用的差异分析采用单向方差分析， THP对胃癌组织的抑制作用和一些临床因素的相关性分析采用双变量相关分析，Spearman相关系数。
2结果
2.1温热化疗对胃癌组织的作用
4种药物对胃癌组织均具有一定的杀伤作用，见表2。其中，DDP、MMC和THP三种药物具有温热协同效应，温热处理的抑制作用均较单独处理有所增强（t值分别为8.099，8.675，8.553；P值均为0.000）；5?Fu未见明显温热协同效应（t＝0.880，P＝0.385）。THP单独处理和温热协同处理均具有较强的抑制作用，和其他3种药物抑制率比较具有显著性差异（P<0.05）。表2 药物对胃癌组织的温热协同抑制率（略）
2.2THP对胃癌组织作用和临床因素的关系
THP对胃癌组织的抑制作用和一些临床因素的相关性研究表明（表1），THP对肿瘤的抑制效应和年龄、性别、术前CEA水平、临床分期和肿瘤大小无关（P>0.05），而与肿瘤的病分级有关。随着组织分级从高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌到印戒细胞癌，THP抑制率呈现下降趋势（P＝0.000）。37℃时Spearman相关系数γ＝-0.479，P＝0.003；42℃时Spearman相关系数γ＝-0.843，P＝0.000。而其他几种化疗药物DDP、MMC、5?Fu无论是在37℃或者是42℃情况下，对肿瘤的抑制效应和年龄、性别、术前CEA水平、临床分期、肿瘤大小和肿瘤组织分级均无关（P>0.05）。
2.3原位细胞凋亡检测4种药物对胃癌组织均具有一定的凋亡诱导作用，见表3，图1a、b。其中，DDP、MMC和THP三种药物具有温热协同效应，温热处理均较单独处理具有显著增加的凋亡指数（P值均＜0.05）。THP温热协同处理均具有较强的凋亡效应，其凋亡指数和其他3种药物比较具有显著性差异（P<0.05）。表3 四种药物的温热化疗对胃癌组织的凋亡诱导作用（略）
2.4HE染色和电镜分析HE染色结果表明，THP和温热协同对胃癌组织具有显著的杀伤效应，光镜视野下肿瘤组织丧失完整的形态结构，肿瘤细胞严重坏死，细胞核大部分固缩，胞浆散失并伴有大量核碎片化现象，见图1c、d。电镜分析表明经THP和温热协同处理后细胞呈现早期、中晚期凋亡特征，胞膜内陷，胞浆空泡化，并出现染色质浓聚，同时核膜消失，见图1e、f。
3讨论
胃癌占消化道肿瘤死亡人数的一半和各种恶性肿瘤死亡总数的1/5，居恶性肿瘤死亡的前列。近些年来，随着外科手术的进展，术后淋巴结复发已明显减少，取而代之的是腹腔转移和复发。如何预防术后腹腔复发是胃肠道肿瘤急待解决的问题。
目前，术中腹腔内温热灌注化疗已逐渐成为大多数学者公认的进展期胃肠道肿瘤的有效方法。术中腹腔内温热灌注化疗使胃肠道肿瘤术后腹腔转移和复发取得明显疗效，并能显著提高生存率，但其中还有许多细节问题值得探讨，如化疗药物的选择、具体方法的选择、药液容量、剂量的确定等,都是亟待解决的问题。
吡柔比星化学结构中有一四氢吡喃基团，因此能够部分绕过gp170糖蛋白所介导的对阿霉素的耐药性[2]。研究表明，白血病细胞HL?60对THP的摄入非常迅速，在1μg/ml的浓度下30s内THP的累积摄入量为0.262μg，主要吸收进入细胞核；而阿霉素仅为0.0015μg，大部分处于胞浆，同时，THP的排出较慢，细胞内能保留高浓度[3]。Sugano等［4］在膀胱癌腔内灌注动物模型中的研究表明,THP对癌肿有较强的穿透性,能够在60min内穿透2～3mm组织,而阿霉素仅能穿透1mm。因此，THP在温热灌注化疗中具有较好的临床应用前景。
目前，国际上有关THP在温热灌注化疗中的基础研究和临床应用的报道甚少。本研究结果显示THP42℃协同对胃癌组织的杀伤效应高于目前的常用药如DDP、MMC和5?Fu。本研究前期工作表明，人胃癌MGC?803细胞经THP和温热协同处理后，处于S期的细胞增多，G2/M期细胞减少［5］。
有报道表明，THP对处于G2/M期细胞的杀伤作用最强，而对G0/1期细胞的杀伤作用较弱。由于温热协同不能增加细胞对THP的摄取。因此，通过温热处理阻滞细胞周期于G2/M期，是增加细胞对THP的敏感性的重要机制。
临床因素相关性分析表明，THP在37℃或者42℃的杀伤作用和患者年龄、性别、临床分期、肿瘤大小和术前CEA水平没有明显关系，而与胃癌的组织病理学分级有关，其抑制作用在高分化腺癌最强。国外临床试验研究表明，术中温热灌注化疗的临床疗效和临床分期有关，对于胃癌Ⅱ、Ⅲ期患者，术中温热灌注化疗能够显著延迟复发，延长患者生存时间，而对于Ⅲ期以上患者，术中腹腔内温热化疗并无显著性生存优势[6]。考虑本研究是局部对胃癌组织的体外研究，影响因素相对比较少，而临床研究结果与很多临床因素有关，比如术中腹腔内温热化疗的术中副作用和相关并发症的可能对临床疗效均有影响。所以THP对胃癌组织的抑制作用的高低与临床疗效的好坏不一致并不矛盾。
一般认为在全身化疗中，肿瘤分化程度低，THP的作用效果好。而本研究结果提示肿瘤分化程度高，THP抑制肿瘤组织作用效果好。这可能与本研究使用局部化疗时药物浓度远远高与全身化疗的药物浓度有关。由于THP的渗透性好，渗透入细胞内药物浓度远远高于耐药蛋白将药物泵出肿瘤细胞的浓度，这时耐药蛋白对抗拒化疗所起的作用相对很小，故THP灌注化疗对耐药蛋白功能较完善的高分化的肿瘤细胞效果更好。而其他的化疗药物如DDP、MMC、5?Fu与组织学分级无相关性的原因也可能与它们的渗透性相对较差有关。
综上所述，THP对胃癌组织具有良好的温热协同效应和肿瘤杀伤效果,具有腹腔内温热灌注化疗的研究应用价值。在临床上选择合适的临床分期和组织学分级胃癌病例在围手术期进行术中腹腔内温热化疗是有意义的。
【】
［1］Furukawa T,Kubota T,Hoffman RM.Clinical applications of the histoculture drug response assay[J].Clin Cancer Res,1995,1(3):305?311.
［2］Furukawa T,Kubota T,Murata H,et al.Antitumor spectra of anthracyclines against gastric cancer tissues obtained from surgical specimens with reference to P?glycoprotein expression[J].J Surg Oncol,1998,69(3):173?177.
［3］Kubota T,Furukawa T,Tanino H,et al.Pirarubicin might partly circumvent the P?glycoprotein?mediated drug resistance of human breast cancer tissues[J].Anticancer Res,1998,18(2A):967?972.
［4］Sugano O,Shoji N,Hatakeyama T,Kato H.Investigation of retention time of intravesical instillation therapy with pirarubicin (THP) [J].Gan To Kagaku Ryoho,1996,23(9):1169?1174.
［5］孙跃民，傅军，袁兴华,等.吡柔比星在体外胃癌细胞温热化疗中协同作用的探讨［J］.肿瘤临床,2005,32(18)：1045?1048．
［6］Fujimoto S， Takahashi M， Kokayashi K，et al.Relation between clinical and histologic outcome of intraperitoneal hyperthermic perfusion for patients with gastric cancer and peritoneal metastasis[J].Oncology,1993,50(5):338．
