Midkine与肿瘤关系的研究进展

【关键词】  MK；基因表达；肿瘤

    Midkine（MK）是1988年Kadomatsu等用差异杂交的方法在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM?1细胞cDNA文库中筛选出的一种新基因。它与PTN（多效营养因子，又称肝素结合相关因子）基因结构很相似，共同组成MK家族。二者均由5个外显子和4个内含子组成，其中外显子Ⅰ为非翻译区，外显子Ⅱ编码信号肽和N端几个氨基酸残基，Ⅲ和Ⅳ编码核心区域氨基酸残基，Ⅴ编码C端氨基酸残基，只是外显子Ⅴ和内含子大小不等。人的MK基因位于ｐ11.2，该基因上游有视黄酸应答因子的位点、IgG增强子元件、AP?1和NF?kB结合位点、ＷＴ1(Wilm′s肿瘤抑制基因产物 1)的作用位点(5′?GCGGGGGGCG?3′)及固醇类/甲状腺激素受体结合位点，这些位点均与基因的表达调控相关，见图1。

    图1  MK基因上游的调控位点和外显子I的示意图

    1  MK基因表达与肿瘤的关系

    MK高表达于许多肿瘤组织中，Tsutsui等用Northern Blot法发现MK在Wilm's肿瘤、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌及食管癌中较相对的癌旁组织均有不同程度的高表达；O'Brien等用核酸酶保护分析法发现，MK在膀胱癌中有高表达；Nakanishi等运用Northern Blot、原位杂交及免疫组化技术研究表明，卵巢癌中MK的表达水平也高； Miyashiro等运用RT?PCR、Northern Blot及免疫组化等方法检测到乳腺癌中高表达的MK。随后，在前列腺癌、肺癌、脑肿瘤、甲状腺乳头状瘤、子宫颈癌[1]和大量的消化道、消化腺肿瘤中也发现高表达的MK。

    近年来对MK表达水平的研究结果表明，MK的表达与肿瘤的进程及严重程度密切相关，国外Mishima等用Northern和Western印迹法检测发现MK在高度恶性的星形细胞瘤组织中的表达显著高于低度恶性肿瘤组织；O'Brien等发现在膀胱癌中MK的表达水平与癌的发展有关，尤其在浸润性膀胱癌中，MK的高表达程度与预后不良密切相关。国内殷正丰等[2,3]应用免疫组织化学染色和Western印迹等方法研究发现原发性肝细胞癌（HCC）的MK表达增加，可能与肝内侵袭、转移和HCC的血行播散有关；此外，Konishi等[4]的研究还发现，除了在恶性肿瘤中有高频率、高程度的表达外，MK在癌前病变组织中也有高表达。他们对15例潜伏期前列腺肿瘤及正常前列腺组织进行免疫组化分析研究显示，80%的潜伏期肿瘤有MK高度表达，而正常组织不表达或仅微弱表达MK，由此认为检测组织中MK表达水平可用于肿瘤的早期诊断。

    肿瘤患者的血液和尿液中也存在MK。2000年Ikematsu等[5]对10种肿瘤疾病患者血清中MK的含量进行了研究，发现MK在肿瘤患者血清中的含量明显增加，87%的肿瘤患者血清中MK水平高于0.5 ng/ml，而对照组血清中仅为0.154  ng/ml，肿瘤切除后，血清中MK的含量明显下降。Shimada等[6]研究认为，血清中MK含量的增加可作为食管癌的诊断标记。Obata等[7]报道，胃癌患者血清中MK含量显著提高，而且晚期癌的血清MK含量高于早期瘤。Ikematsu等[8]2003年又报道了，胃癌、直肠癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、脑癌、膀胱癌、肾癌及甲状腺癌等肿瘤患者尿液中的MK含量也显著增高，II期胃癌和直肠癌的阳性率高于I期。由此可见，通过检测血清或尿液中MK的水平进行临床肿瘤诊断和分期是可能的。

    2  MK表达产物的定位

    关于MK在细胞中的定位目前结论并不一致，有报道认为它们存在于细胞质，也有报道认为存在于细胞核、核仁。罗祥基等应用免疫组织化学与原位杂交的方法研究发现，MKｍRNA及蛋白的阳性信号聚集于HCC肿瘤细胞的细胞质，并在HCC细胞外组织中的血管密集处MK表达尤为明显；目前已发现的细胞表面的MK受体包括syndecan 家族成员、 蛋白多糖受体型酪氨酸激酶f(PTPζ)、一种跨膜的低密度脂蛋白 (LDL)受体相关的蛋白(LRP)以及间变性淋巴瘤激酶(ALK)等。2005年Dai等[9]通过使用GFP作为示踪分子研究发现，MK特异的定位于HepG2细胞的细胞核和核仁，并通过点突变和缺失突变比较分析成功地确定了MK细胞核定位的核心区域为K79R81、K86K87和C端尾部，对于MK核仁定位，C端最为关键，其次为N端尾部、K79R81和K86K87。

    3  MK致瘤的分子机制

    目前的研究表明MK与肿瘤形成相关的分子机制主要有诱发瘤细胞的发生、促纤溶和具有细胞趋化作用、促进肿瘤血管的形成、增强肿瘤细胞的耐药性以及缺失型MK（tMK）表达的出现等几种形式。

    3.1  瘤细胞的发生  主要包括诱导细胞的转化、抗细胞凋亡和促有丝分裂。首先，MK可以诱导多种细胞的转化。Kadomatsu等研究表明MK诱导转化的NIH3T3细胞具有较高的增殖能力，可在裸鼠中形成肿瘤组织，Stoica等[10]研究表明MK转化的SW?13细胞能在裸鼠中成瘤，而且揭示MK是通过与ALK（间变性淋巴瘤激酶，PTN受体）结合实现的。此外MK还可刺激WI?38人成纤维细胞的ALK磷酸化，在表达ALK蛋白的WI?38、 源于脑微脉管系统和脐血管的人内皮细胞（HUVEC）、成神经细胞瘤(SH SY?5Y)和成胶质细胞瘤(U87MG)的细胞内激活PI3激酶和MAP激酶信号传导通路。其次，一定量的MK可保护G401细胞系免于顺铂诱导的程序死亡, 防止持续光照所致的光受体细胞的变性等。对细胞的保护作用提示MK在肿瘤细胞中可能以抗凋亡的形式来促进瘤的生成。Shibata等[11]发现MK能被人工培养的小鼠细胞吞噬后进入细胞核内，成为抗细胞凋亡过程中的必需成分。并进一步发现MK所调控的细胞抗凋亡机制均与PI3K和MAPK信号通路相关。在对G401细胞系的研究中发现MK作为一种自分泌的丝裂原与该细胞表面的MK高亲和力受体结合，可通过JAK/STAT途径调控细胞间蛋白酪氨酸的磷酸化诱导的有丝分裂。此外，Sandra等[12]对MK在造釉细胞瘤形成中可能的作用进行了研究，发现MK可通过MAPK和Akt信号通路促进细胞分裂，诱导造釉细胞瘤的发生。

    3.2  促纤溶和细胞趋化性  促纤溶和细胞趋化性与肿瘤增殖和转移相关，Kojima等以牛动脉内皮细胞为材料研究发现，MK可通过上调尿激酶型纤溶酶激活物及下调纤溶酶原激活物抑制因子?1的表达等，提高血管内皮中血浆酶原活化因子（PA）/纤溶酶的水平，增强纤溶作用，并指出起关键作用的是MK分子C端的43个氨基酸多肽。许多研究发现MK对中性白细胞、成骨细胞、骨肉瘤细胞、神经细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞等具有趋化作用，并且发现除N?Syndecan 和 PTPζ与此作用相关外，硫酸软骨素尤其是硫酸软骨素E在MK介导的细胞迁移过程中起至关重要的作用，该作用也与PI3K和MAPK信号通路相关 [13]。

    3.3  促进血管形成  血管的形成与肿瘤增殖和转移相关，Muramaki等[14]将MK基因导入到膀胱癌细胞中研究，发现M的过量表达可促进血管内皮细胞的生长，从而刺激提高血管的形成活性，最终导致恶性肿瘤的发生。还发现MCF?7乳腺癌细胞表达的MK可诱导兔角膜强烈的生血管反应。此外，国内也有研究表明，在乳腺癌[15]等多种肿瘤中过量表达的MK与该肿瘤的血管生成密切相关。

    近年来基因方面的研究也从反面证实了MK的致瘤性，例如Takei等[16]的研究发现MK的反义寡脱氧核糖核酸能有效地抑制细胞生长及裸鼠结肠癌细胞的生长，并认为MK是通过抑制atelocollagen所介导的基因转移来实现的，而且MK的反义寡脱氧核糖核酸影响肿瘤生长的最重要的两个因素是抑制癌细胞有丝分裂和肿瘤血管生成。

    3.4  耐药性的产生  Kang等[17]对具有获得性抗药性的胃肿瘤细胞株中基因的表达进行分析，发现MK在所有的耐药细胞株中都是超量表达的，推测MK的表达增强了胃肿瘤细胞的抗药性。

    ３．5  缺失型MK（tMK）的表达  tMK是1996年Miyashiro等在用RT?PCR的方法研究结直肠癌组织中MK的表达时发现的。目前研究人类肿瘤组织时发现的tMK都是MK选择性剪接的变异体，缺失了主要编码N端功能区及附近氨基酸的外显子Ⅲ。由于它的C端功能区仍存在，因而保留了完整MK的大多生物学活性。

    研究发现，tMK只在肿瘤组织中表达且在胃肠癌的转移性淋巴结高频率表达，而不出现在正常组织中，2001年Paul等[18]成功的制备了tMK的单抗，并通过免疫组化发现tMK在Wilm's瘤细胞也有特异性的表达，此外，在其他多种肿瘤中都发现有tMK特异性的表达。可见，tMK在肿瘤中表达的特异性可能使它成为肿瘤诊断的新标志和治疗肿瘤的新靶点。而且可以推测：（1）MK表达的增多只是癌发生的一个基础，而tMK是其真正发展成癌的一个关键条件；（2）tMK是由已发展成癌的组织细胞内代谢紊乱而表达的，是癌自我促进发展的物质。虽然Nobata等[19]的研究提示MK基因内含子3的第62个碱基G被T替换可能提高结肠癌中tMK的表达，但是关于MK与tMK间的相互作用及它们对肿瘤发生和发展的确切机制仍不清楚。

    4  结束语

    自1988年来，人们对于MK的表达与肿瘤关系的已做了大量的研究，然而MK在不同性别、年龄和种族的肿瘤患者中表达水平差异的研究仍未开展，因此，若将MK作为肿瘤诊断指标和靶点，还需进行大量的临床和基础研究。

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