NS?398对肝细胞癌VEGF、MMP?9表达的调节
【摘要】 目的 探讨NS?398对肝细胞癌血管生成和侵袭的调节作用。方法 NS?398取0、25、50、75、100μmol/L 5个浓度组，每个浓度组选取24h、48h、72h三个作用时间点进行检测。采用RT?PCR和流式细胞技术，观察NS?398对人肝癌SMMC?7721细胞株VEGF、MMP?9表达的影响。结果 NS?398对SMMC?7721细胞有明显的生长抑制作用。与对照组相比，NS?398能显著抑制SMMC?7721细胞COX?2、VEGF、MMP?9基因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（P<0.001）。结论 NS?398能显著抑制SMMC?7721肝细胞癌中VEGF、MMP?9 mRNA和蛋白的表达。
【关键词】 肝细胞癌 NS?398 血管内皮生长因子 MMP?9
0 引言
环氧合酶?2（Cyclooxygenase?2，COX?2）不但与肿瘤血管生成有关［1］,还可通过改变肿瘤细胞的侵袭性和粘附性来抑制肿瘤生长［2］。我们以前实验表明肝细胞癌组织中COX?2与VEGF、MMP?9蛋白表达和肿瘤微血管密度（Microvessel density，MVD）之间呈正相关［3］，本实验研究COX?2特异性抑制剂——NS?398对肝癌SMMC?7721细胞株VEGF、MMP?9表达的影响，初步探讨NS?398对肝细胞癌血管生成和侵袭的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养和药物干预方案
SMMC?7721细胞分别用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液在含5％ CO2 37℃培养箱中培养。培养液中分别含有青霉素、链霉素100U/ml。将对数生长期的细胞接种于96孔培养板，待细胞贴壁后加入NS?398。NS?398取0、25、50、75、100μmol/L 5个浓度组，每个浓度组选取24h、48h、72h三个时间点。每个实验组重复6孔。
1.2 主要试剂
NS?398购自sigma公司。一抗山羊抗人COX?2多克隆抗体，鼠抗人VEGF单克隆抗体，兔抗人MMP?9单克隆抗体均为Santa Cruz产品， Trizol试剂（美国Gibco BRL公司）。PCR仪（美国PE公司PE?9600型），流式细胞仪（美国B?C公司Epics?XLⅡ型）。
1.3 RT?PCR检测COX?2、VEGF、MMP?9 mRNA的表达
按照Trizol试剂说明书逐步提取细胞总mRNA。COX?2反应条件为: 94℃变性30s；63℃复性30s；72℃延伸30s。VEGF反应条件为: 94℃变性30s；63℃复性30s；72℃延伸30s。MMP?9反应条件为： 94℃变性30s； 63℃复性30s； 72℃延伸30s。进行35个循环后进一步延伸72℃ 5min。COX?2引物序列: 上游为5’?AAT GAG TAC CGA AAA TTC?3’，下游为5’?CAT CTA GTC CGG AGC GGG AAG?3’，扩增片段大小为420bp。VEGF引物序列: 上游为5’?TTG CCT TGC TGC TCT ACC TC ?3’，下游为5’?AAA TGC TTT CTC CGC TCT GA ?3’，扩增片段大小为418 bp。MMP?9引物序列：上游：5’?TTG CCT TGC TGC TCT ACC TC?3’，下游：5’?AAA TGC TTT CTC CGC TCT GA ?3’,扩增片段大小为120bp。所有引物均由上海生工公司合成，选取β?actin为内参照，取10μl PCR产物用1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳后，凝胶电泳成像系统观测成像情况。
1.4 流式细胞仪定量检测COX?2、VEGF、MMP?9的表达
采用间接免疫荧光标记方法。每份样品加入第一和第二抗体工作液各100μl。设有PBS代替一抗和二抗的阴性对照，只加一抗和二抗的阳性对照。以荧光指数（FI）表示相对含量，FI=（样品蛋白表达荧光强度?正常样品的荧光强度）/正常样品的荧光强度。
1.5 MTT法检测细胞增殖抑制情况
在96孔培养板中分别加入25、50、75、100μmol/L NS?398，继续孵育24、48、72h后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育4～5h，吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度（A）。每组取3次实验平均值，细胞抑瘤率：抑瘤率＝（对照组A－实验组A）／（对照组A－空白组A）×100%。
1.6 统计学检验
应用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，组间显著性检验采用析因设计方差分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 NS?398对SMMC?7721细胞生长的影响
MTT法测定结果显示，NS?398对SMMC?7721细胞有明显的抑制生长作用，并呈剂量依赖性和时间依赖性（P<0.001）, 见图1。
2.2 NS?398对SMMC?7721细胞COX?2表达的影响
RT?PCR和FCM结果表明，NS?398能显著抑制SMMC?7721细胞COX?2基因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（P<0.001）。
图1 NS?398 对SMMC?7721细胞生长的抑制作用（略）
2.3 NS?398对SMMC?7721细胞VEGF、MMP?9表达的影响
NS?398能显著抑制SMMC?7721细胞VEGF、MMP?9基因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（P<0.001），见表1、2。
表1 NS?398对SMMC?7721细胞COX?2、VEGF、MMP?9蛋白表达的影响（略）
表2 NS?398对SMMC?7721细胞COX?2、VEGF、MMP?9 mRNA表达的影响（略）
3 讨论
COX?2新近被证实具有促进肿瘤生长作用，可影响肿瘤细胞增殖、分化和凋亡，最近还发现COX?2可通过刺激肿瘤血管生成、促进细胞侵袭和转移能力来促进肿瘤发生和。血管生成是肿瘤发生、发展过程中的重要步骤，与肿瘤的生物学行为及预后有关。VEGF是肿瘤血管生成和侵袭转移过程中的关键因素，其通过特异性受体Flk?1、Flt?1和Flt?4选择性作用于内皮细胞发挥作用。MMP?9是基质金属蛋白酶家族中的重要成员，其过度表达与肝细胞癌血管生成和侵袭转移密切相关。
已有研究表明COX?2在肝细胞癌中高表达，但对COX?2与肿瘤血管生成的研究较少。Tsujii等［1］研究发现，转染COX?2基因可以使培养的结肠癌细胞株在过度表达COX?2的同时，促使VEGF、TGF?β和bFGF等肿瘤血管生成因子的分泌，并促进联合培养的人脐静脉内皮细胞株在Ⅰ型胶原凝胶中增殖、变形、向肿瘤细胞迁移和形成网状的内皮细胞索。Liu等［4］进一步进行体内研究，结果显示选择性COX?2抑制剂能显著抑制前列腺癌血管生成。Tsujii等［5］将COX?2基因转染入人结肠癌细胞株，发现该转染细胞具有更强的侵袭能力，同时可以被COX?2选择性抑制剂阻断。进一步研究发现，这种侵袭能力的增强与MMP?2的活化及MMP?1的表达增加有关。以前实验已证实肝细胞癌组织中COX?2与VEGF、MMP?9和MVD表达之间存在着正相关，本研究结果显示COX?2特异性抑制剂NS?398可以显著降低肝癌SMMC?7721细胞株VEGF基因和蛋白的表达水平，进一步表明在肝细胞癌COX?2可通过上调VEGF与MMP?9表达水平来促进肿瘤血管生成和侵袭。
肿瘤细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞在细胞因子诱导下，可上调COX?2表达[6]，增加的PGEs与PGE受体结合，通过EP/cAMP等途径激活各种胞内激酶，与核内受体PPARγ等结合后作用于或直接作用于VEGF、MMP?9基因[7]，诱导VEGF、MMP?9表达水平上调，但具体机制尚有待于进一步研究。
【】
［1］ Tsujii M, Kawano S, Tsuji S,et al. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells[J]. Cell,1998,93(5):705?716.
［2］ Tsujii M, DuBois RN. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2[J]. Cell,1995,83(3):493?501.
［3］ 彭利, 左连富, 王顺祥,等. 肝癌组织中COX?2、VEGF、MMP?2、MMP?9的表达及相互关系的免疫组织化学研究[J]. 实用肿瘤杂志，2005，20（2）：134?136.
［4］ Liu XH, Kirschenbaum A, Yao S, et al. Inhibition of cycl?ooxygenase?2 suppresses angiogenesis and the growth of prostate cancer in vivo[J].J Urol, 2000,164（3 pt 1）:820?825.
［5］ Tsujii M, Kawano S, DuBois RN. Cyclooxygenase?2 expression in human colon cancer cells increases metastatic potential[J]. Proc Natl Acad Sci,1997,94（7）:3336?3340.
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