p19ARF和p16INK4a在人骨肉瘤中表达的比较研究
【摘要】 目的 比较p16INK4a和p19ARF两种抑癌基因在可切除的人骨肉瘤组织中的表达形式,探讨其在人骨肉瘤的发生、中的意义。方法 人骨肉瘤切除石蜡标本37例,用单克隆抗体间接免疫荧光法同时测定肿瘤组织的p16、p19蛋白的表达。结果 p16INK4a表达率56.8％（21/37）， p19ARF表达率40.5％（15/37）；p16与p19表达无相关性；p16和p19与骨肉瘤的外科分期、病理分级、血管浸润和肺部转移均无显著相关。结论 p16、p19的下调都很可能是骨肉瘤发生发展的重要原因之一，未发现这两种抑癌基因之间的表达有显著关系。
【关键词】 人骨肉瘤 p16INK4a p19ARF 周期蛋白依赖激酶抑制剂
0 引言
p16IN K4a(以下简称p16) 基因改变在人类恶性肿瘤中普遍存在[1,2], 包括人骨肉瘤[3]。p16基因所在的IN K4a 位点还编码一种p19ARF (以下简称p19)基因,它是p53的上游基因,也是一种重要的抑癌基因[4]。迄今尚未见有关p19在人骨肉瘤组织中表达情况的报道。本文通过检测人类可切除性骨肉瘤组织中p16和p19蛋白的表达形式,探讨这两种抑癌基因在骨肉瘤中的意义。
1 资料与方法
1.1 对象与标本 骨肉瘤标本37 例, 同济2001年1月～2004年6月手术切除并石蜡包埋标本37例，男性21例，女性16例，年龄12～57岁。标本经甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚度5μm。所有病例术前均未接受过放化疗。
1.2 实验方法与主要试剂 应用间接免疫荧光法检测组织中p19和p16的表达: 5μm连续切片,脱腊至水;每个标本切两张，分别加入25μl的p19和p16的一抗，完全覆盖住玻片上的组织，室温孵育60min；用洗涤液洗3次，各5min。加入标记FITC标记的抗体（二抗）25μl，室温孵育20min。用固定液封片。观察前空气干燥30min。
所用两种一抗分别为鼠抗人p19单克隆抗体(武汉晶美公司 ),工作浓度1∶100;鼠抗人p16单克隆抗体(武汉晶美公司),工作浓度1∶100;二抗为FITC标记酶羊抗鼠IgG(武汉晶美公司)，工作浓度1∶100。
1.3 结果判定 荧光显微镜下观察染色切片，胞浆或胞膜出现绿色颗粒为阳性细胞。每张切片随机观察5个高倍视野按阳性细胞所占比例分为“-”：细胞未染色；“+”：阳性细胞<50%; “++”: 阳性细胞>50%。
1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0软件分析, P＜0.05为有显著差异。
2 结果
2.1 p16和p19在骨肉瘤中的表达 骨肉瘤中的p16表达率56.8％（21/37）；骨肉瘤中的p19表达率40.5％（15/37）。在骨肉瘤中，p16和p19的表达无明显相关性，同时表达p16和p19的有5例，见表1。
表1 骨肉瘤分型与p16和p19表达的关系（略）
从表达形式看，p16在骨肉瘤中有胞浆型12例和胞膜型9例。p19在骨肉瘤中的表达有胞膜型8例，胞浆型3例和核型4例。
2.2 p16和p19的表达阳性者，年龄集中于10～20岁；男性阳性比例高于女性尤以p16较明显。
2.3 p16和p19的表达与骨肉瘤病指标的关系，见表2。
表2 骨肉瘤病理学指标与p16和p19阳性率（略）
注：37例病史资料完整，32例有肿瘤大小及分化的病理资料; * 高分化 vs 中、低分化
3 讨论
骨肉瘤是运动系统常见的恶性肿瘤，可发生于各种年龄，其中75%发生于青少年，病情凶险，预后较差，多数病例在原发灶较小的早期即发生广泛的肺转移，越来越多的研究结果表明，骨肉瘤的恶性表型及预后与癌基因的过量表达和抑癌基因缺失密切相关[5]。
p16基因编码的p16蛋白为细胞周期的一种负性调节因子，其缺失为肿瘤的侵润和转移提供了选择性的生长优势。p16蛋白可与细胞周期素D竞争结合细胞周期依赖性激酶（CDK4），使CDK4失活，从而阻止Rb的磷酸化，去磷酸化的Rb以活性形式结合E2F及ATF2等转录因子，阻止细胞从G1期进入S期[6]。p19是近年被注意到的一种潜在重要的抑癌基因，它与p16虽然位于同一个基因位点，有一个外显子相同，但阅读框架不同，因而抑癌机制不同，p16通过pRb起作用，而p19则通过上游基因p53起作用。有人发现人类p19ARF通过结合MDM2并加速其衰解，从而加强p53蛋白的稳定性，引起p53在体内的积聚[7,8]。敲除p19而保留p16表达的细胞，迅速产生各种肿瘤，提示在某些肿瘤p19才是真正的肿瘤抑制蛋白。缺乏p19的小鼠早年就会发生肿瘤[9]。已发现在人T细胞白血病、非小细胞和口腔磷癌有p19的下调，而在骨肉瘤尚无报道。
本实验用免疫荧光间接法同时检测在同一骨肉瘤组织中p16和p19这两种既相互联系，又完全不同的抑癌基因的表达。我们发现在骨肉瘤中，两者的表达率都比较高（56.8％和40.5％），但两者间无明显相关性，同时表达p16和p19的只有5例。
我们的研究发现，p16和p19的表达率与骨肉瘤的病理分期负相关，提示p16及p19的异常可能与骨肉瘤的进展有关（见表2）。两者虽然在有肺转移的病理切片中的表达率比较高，但由于例数不多，统计学上无显著意义。
综上所述，我们的研究证实p16及p19的下调和骨肉瘤的发生有密切联系，并且这两种抑癌基因之间的表达无显著相关。目前认为肿瘤的发生机制是多基因多步骤的，1995年cyclin D1?CDK4?p16?PRb Path way理论[10]的提出揭开了多因素研究的序幕，今后骨肿瘤病因学研究也将沿此方向深入下去。本实验还证实p16INK4a和p19ARF在骨肉瘤中表达途径不同，为进一步研究使用多基因联合骨肉瘤提供了实验基础。
【】
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