实时荧光定量PCR检测大肠癌腹腔微转移及其临床意义
作者：钱俊 郑树 中西速夫 光幸秀 平井孝 加藤知行
【摘要】 目的］ 应用实时荧光定量PCR技术检测大肠癌腹腔内游离癌细胞并探讨其临床意义。［方法］ 2003年5月至2004年1月，收集在日本爱知癌症中心手术81例大肠癌病例的腹腔冲洗液，每个样本的cDNA均应用两种引物合成（随机引物和寡核苷酸引物），并在罗氏实时荧光定量PCR（LightCycler）上进行定量分析。每个样本同时进行常规细胞学检查。所有病例术后经过平均为1年的随访。［结果］ CEA mRNA 和CK-20 mRNA的阳性率和阳性值均与肿瘤的浸润深度（T）、分期以及淋巴结转移相关。在一个合理界定值上，CEA 和CK-20检测的敏感度与特异度均为100%，而常规的细胞学检查则为33%和100%。［结论］ CEA 和CK-20 mRNA定量分析是检测大肠癌腹腔微转移的敏感和特异的方法，CEA 和CK-20 mRNA水平的异常与术后的无瘤生存率显著相关。
【关键词】 大肠肿瘤 癌胚抗原 细胞角蛋白20 实时荧光定量RT-PCR
Quantitative Detection of Disseminated Cancer Cells in Peritoneal Washes with Real-Time RT-PCR for Patients with Colorectal Carcinoma and Its Clinical Significance
Abstract: ［Purpose］ To detect the free cancer cells in peritoneal cavity in patients with colorectal cancer by quantitative real-time RT-PCR method and investigate its clinical significance. ［Methods］ From May 2003 to Jan. 2004, peritoneal wash was obtained from 81 cases with colorectal cancer in Aichi cancer center. cDNA was synthesized from mRNA extracted from peritoneal washes by 2 kinds of primers (random primer and oligo primer). Quantification of CEA and CK-20 mRNA was performed on a LightCycler instrument with hybridization probe. A part of each peritoneal wash was also examined by conventional cytology. All patients were followed up with an average period of 12 months. ［Results］ Both CEA mRNA and CK-20 mRNA positive rates and values were significantly correlated with depth of tumor invasion, staging, lymph node metastasis. Sensitivity and specificity of CEA and CK-20 real-time RT-PCR with an appropriate cutoff value were all 100%, whereas those of conventional cytology were 33%, and 100%, respectively. ［Conclusion］ Both CEA and CK-20 mRNA quantifications are sensitive and specific methods for detecting micrometastasis in the peritoneal washes with colorectal cancer. Abnormality of CEA and CK-20 mRNA in peritoneal washes is correlated with disease free survival for colorectal cancer.
Key words: colorectal neoplasms; carcinoembryonic antigen; cytokeratin-20; real-time RT-PCR
大肠癌为常见多发的消化道恶性肿瘤，随着生活水平的提高和饮食习惯的改变，大肠癌的人群患病率有所上升，并有年轻化趋势。目前，大肠癌病人尽管接受了以手术为主的根治术，但临床上仍有50％的大肠癌患者死于术后的肿瘤局部复发和转移，成为手术失败的主要原因[1,2]。因此，应用先进的分子生物学技术、建立定量荧光RT-PCR方法检测大肠癌肿瘤标志物、术后转移的早期诊断受到高度重视。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是大肠癌细胞去分化过程中表达的一个重要标志，是最有价值的肿瘤标志物之一。细胞角蛋白20（cytokeratin-20，CK-20）是上皮细胞骨架的组成成分，表达于正常上皮及上皮源性原发肿瘤及其转移肿瘤细胞。CK-20表达范围严格，它仅局限在胃肠上皮细胞，且在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时，始终保持稳定。胃肠道检测细胞角蛋白20（CK-20）mRNA（CK-20 mRNA）可作为大肠癌患者血及骨髓转移的重要标志物。本研究应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参因子[3]，检测大肠癌病人手术腹腔冲洗液中游离细胞的CEA mRNA和CK-20 mRNA，结合术后对病人随访，研究结果将为正确诊断肿瘤浸润程度和复发可能性，对大肠癌术后转移的早期诊断有重要意义，同时为肿瘤病人术后放疗、化疗方案的确定提供依据。
1 材料与方法
1．1 细胞株
人结肠癌肝转移表达CEA中分化腺癌细胞株，由日本爱知癌症中心癌症研究所肿瘤病理实验室建立，并培养于加入10%小牛血清（GIBCO BRL, Gaithersburg），100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基（Nissui Pharmaceutical，Tokyo，Japan）中。
1．2 病例收集
收集从2003年5月至2004年6月在爱知癌症中心手术的81例大肠癌病例，其中包括39例结肠癌，40例直肠癌，以及2例结直肠双发癌。病例分期根据2001版UICC分期：2例0期，3例Ⅰ期，34例Ⅱ期，31例Ⅲ期，11例Ⅳ期。
1．3 腹腔冲洗液收集和保存
手术开始进腹后，立刻分别用100ml生理盐水冲洗盆底和膈下，轻微搅拌后回收冲洗液。离心（1 800r/min，5min），PBS重新冲洗游离细胞沉淀，溶解于Isogen溶液中(Nippon Gene，Tokyo，Japan)，-80℃保存至使用。其中一部分冲洗液同时做常规Papnicolaou染色，以进行细胞学检查。
1.4 RT-PCR检测
应用随机引物和寡核苷酸引物检测腹腔冲洗液游离细胞CEA mRNA，CK-20 mRNA 和GAPDH mRNA，经细胞总RNA提取——cDNA合成——实时荧光定量RT-PCR步骤。寡核苷酸引物为：CEA引物： 5′-AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT，5′-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG；荧光探针：5′-TGAAATGAAGAAACTACACCAGG，5′-CTGCTATATCAGAGCAA-
CCCCAA；CK-20引物：5′-CAGACACACGGTGAACTATGG，5′-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG；荧光探针：5′-AGACGGTCATTTAGGTTCTGCAT，5′-GCCATTTTCTCATTGCCAACA；GAPDH引物：5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG，5′-TCCACCACCCTGT-
TGCTGTA；荧光探针：5′-TCAACAGCGACACCCACTCCT，5′-CACCTTTGACGCTGGGGCT。
PCR 的扩增使用Roche的LightCycler扩增仪，总反应体积为10μl包括：Taq DNA聚合酶，dNTP混合物和缓冲(LightCycler DNA Master hybridization probes，Roche)，4.0mM MgCl2，0.25μM引物D和E，0.4μM的探针，1μl的模板cDNA，于Roche的毛细管中。95℃(10s)变性，50℃~55℃(10s)淬火，72℃(10s)延伸，共50次循环，每次试验包括6个外对照管，1个阴性对照管，和未知浓度病人样品管。mRNA的定量可在LightCycler上与标准曲线对照后由软件自动得出。
1.5 统计分析
根据肿瘤浸润深度（T）、肿瘤分期、淋巴结转移，应用卡方检验进行组间CEA mRNA 值以及CK-20 mRNA值差异性分析。无瘤生存率用Kaplan-Meier方法计算。
1.6 术后随访
所有病例均入全日本大肠癌病例库并按照爱知癌症中心术后随访程序随访，无失访。随访截至日期到2005年12月31日。
2 结 果
２．1 常规细胞学检查
所有81例病例均做常规病检查，只有1例（1.2%）诊断为阳性。Papnicolou 染色5级。其他71例1级，8例2级，1例3级。
２．2 大肠癌腹腔冲洗液中CEA水平
２．2．1 利用随机引物合成CEA cDNA
由于每个样本，都是用两种不同的引物（随机引物和寡核苷酸引物）来合成cDNA，故可以得到两个不同的实时荧光定量PCR的结果。CEA mRNA（利用随机引物合成）在4个黏膜层和黏膜下层的早期癌中均未能检出。根据以往在爱知癌症研究所的研究结果，将界定值定在1.0。大于1.0定为阳性，小于1.0定为阴性。从盆底和膈下收集的标本只要有一处CEA mRNA值为阳性，该病例定为阳性。
应用实时荧光定量PCR，共检测了81例腹腔冲洗液标本，在pTis-1、pT2、pT3和pT4各组病例中，阳性率分别为0、0、10.9%、30%(P<0.05)，各组病例的平均值分别为：0、0、31.2、12.8，T4病例较低的CEA mRNA值也反映了细胞学检查的结果（0）。CEA mRNA平均值在淋巴结转移阴性，淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为5%（2/40），17.1%（7/41）(P<0.05)，CEA mRNA平均值为8.03，31.05(P<0.01)。CEA mRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各组病例中，阳性率分别为0、3%、9.6%、44.44%(P<0.05)，各组病例的平均值分别为：0、1.16、10.33、112.33(P<0.01)。腹腔转移阳性病例的CEA mRNA平均值（451.95）显著高于腹腔转移阴性病例（6.32）(P<0.01)。
２.２.2 利用寡核苷酸引物合成CEA cDNA
在pTis-1、pT2、pT3和pT4病例中，阳性率分别为0、18.2%(2/11)、41.8%(29/55)、80%(8/10)(P<0.01)，各组病例的平均值分别为：0，45.87，797.08,1163.89(P<0.01)。结果与用随机引物合成的CEA cDNA结果相一致。
CEA mRNA与肿瘤分期：在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各组病例中，阳性率分别为0、35.29%（12/34）、70.96%（22/31）、54.54%（6/11），各组病例的平均值分别为：0、25.38、367.55、3 022.78(P<0.01)。CEA mRNA平均值与淋巴结转移：CEA mRNA平均值在淋巴结转移阴性、淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为 32.5%（13/40）、63.4%（26/41）(P<0.05)，平均值为63.62、1 047.88(P<0.01)。腹腔转移阳性病例的CEA mRNA平均值（10 328.3）显著高于腹腔转移阴性病例（61.8）(P<0.01)。
２.2.3 常规细胞学和实时荧光定量PCR检测
3例有腹膜转移阳性的病例在镜下均诊断为pT3，其中只有1例常规细胞学检查结果为阳性（敏感度为33%）。而实时荧光定量PCR结果均为阳性（敏感度为100%）。
2．3 大肠癌腹腔冲洗液中RT-PCR检测CK-20水平（阳性参考值为0.1）
2.3.1 利用随机引物合成CK-20 cDNA
在pTis-1、pT2、pT3和pT4各组病例中，阳性率分别为0、0(0/11)、14.5%（8/55)、40%（4/10）(P<0.05)，各组病例的平均值分别为：0、0、31.3、12.9，T4病例较低的CEA mRNA值也反映了细胞学检查的结果（0）。
CK-20 mRNA与肿瘤分期关系：在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各组病例中，阳性率分别为0、3.0%（1/34）、16.1（5/31）、54.5%（6/11）(P<0.01)，各组病例的平均值分别为：0、1.10、4.49、501.96(P<0.01)。
CK-20 mRNA平均值与淋巴结转移：CK-20 mRNA平均值在淋巴结转移阴性，淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为 7.5%（3/40）、19.5%（8/41）(P<0.01)，平均值为6.10、133.03(P<0.01)。腹腔转移阳性病例的CK-20 mRNA平均值（1 798.20）显著高于腹腔转移阴性病例（7.30）(P<0.01)。
2.3.2 利用寡核苷酸引物合成CK-20 cDNA
在pTis-1、pT2、pT3和pT4各组病例中，阳性率分别为0、0、25.45%（14/55）、70%(7/10)(P<0.05)，各组病例的平均值分别为：0、0、1 160.7、40.0。T4病例较低的CEA mRNA值也反映了细胞学检查的结果（0）。
CK-20 mRNA与肿瘤分期：在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各组病例中，阳性率分别为0、17.64%（6/34）、32.25%（10/31）、45.5%（5/11）(P<0.01)，各组病例的平均值分别为：0、3.01、14.36、8 284.63(P<0.01)。
CK-20 mRNA平均值与淋巴结转移：CK-20 mRNA平均值在淋巴结转移阴性，淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为 22.5%（9/40）、29.3%（12/41）(P<0.05)，平均值为29.63、2 208.64(P<0.01)。腹腔转移阳性病例的CK-20 mRNA平均值（28 658.63）显著高于腹腔转移阴性病例（73.89）(P<0.01)。
应用随机引物和寡核苷酸引物检测腹腔冲洗液游离癌细胞CEA mRNA与CK-20 mRNA实时RT-PCR结果比较见表1。
2.4 随访结果
随访时间平均为12个月（6~20个月），共有7例患者出现复发和转移，其中包括腹腔内播散2例，肝转移3例，肺转移2例。所有7例患者均为CEA或者CK-20阳性，复发转移率为17.5%（7/40）（剔除3例阳性对照）。其中有3例患者CEA和CK-20阳性均为阳性（3/9，33.3%）。其中有1例，手术时未发现腹膜转移，但CEA和CK-20均为阳性，3个月后再手术行肝转移灶切除术时，探查确认腹膜转移。CEA或者CK-20阳性患者与阴性患者相比较，无瘤生存率有显著性差异（P<0.01）。CEA或者CK-20阳性患者与两者均为阳性患者相比较，无瘤生存率亦有显著性差异（P<0.01）。
３ 讨 论
大肠癌失败的原因之一即是腹腔转移。常规细胞学检查一直以来作为肿瘤腹膜转移的金标准，是肿瘤TNM分期以外的又一肿瘤预后因素，但Wind等[4]报道，常规细胞学检查并不能为大肠癌提供预后信息。肿瘤在进行根治手术后病例仍出现复发，原因通常被认为是手术时腹腔内即已存在从肿瘤浆膜面脱落的癌细胞，而这些脱落细胞通过常规细胞学检查未被发现。本研究中，3例阳性对照病例（腹膜转移）病诊断为pT3，其中有1例常规细胞学为阳性，敏感度为33%，提示建立一种新型的能检出肿瘤微小转移，具备高度敏感和特异方法的必要性。以往有利用常规RT-PCR方法来检测脱落癌细胞，Aoki等[5]报道（2002）以CEA和CK-20为标记物应用常规RT-PCR方法来检测脱落癌细胞，结果提示RT-PCR的结果与肿瘤的浸润深度有关。但常规RT-PCR方法有以下缺点[3]：①它是定性而不是定量的方法，因而缺少对于腹膜转移风险的定量预测。②基因扩增和随后的分析时间长，难以马上获得结果。③有一定的假阳性。报道CEA为(0~33%)，CK-20为（0~8%）[6~9]。而荧光定量RT-PCR方法具有时间短（小于3h），能在手术结束之前完成。具有高度敏感性，能够检测出107个正常细胞中的个数级别肿瘤细胞，不但远远高于常规的检验方法，而且敏感性优于常规RT-PCR[3，10]。CEA和CK-20是检测手术时脱落癌细胞的特异性肿瘤标记物。
本研究每种检测标记物均使用两种引物来合成cDNA，荧光定量RT-PCR技术也有带来假阳性的风险。通过设定界值（本研究CEA为1.0，CK-20为0.1），能够将假阳性控制在较低水平。同时通过两种引物合成能够更好地比较结果，剔除假阳性和假阴性。通过实时荧光定量PCR技术，在CEA为标记物结果中，敏感度和特异度分别为100%和100%（随机引物），100%和100%（寡核苷酸引物）。而在CK-20位标记物的结果中，敏感性和特异性亦均为100%。研究结果表明，两种标记物和两种引物结果的假阳性和假阴性率均较低，结果较为可靠。对于同期别肿瘤，利用寡核苷酸引物较利用随机引物合成检出率高。同标本随机引物合成结果与寡核苷酸引物合成结果一致率为100%，提示在今后研究中利用双引物合成能够更好的提高敏感度和特异度。
本研究的结果显示，通过两种引物合成CEA和CK-20的阳性率以及数值，都与肿瘤的浸润深度pT显著相关(P<0.01)，同时也与肿瘤的期别呈显著相关（P<0.01）。肿瘤的侵润程度越深，CEA和CK-20的阳性检出率就越高。本研究中出现了有pT3组的CEA和CK-20 mRNA平均值高于pT4组的情况，这是由于pT4组病例偏少，以及3例腹膜转移阳性对照位于pT3组的缘故。本研究同时也发现，两种引物合成CEA和CK-20的水平，也与肿瘤淋巴结转移显著相关(P<0.01)。这与之前Nakanishi等[11~14]在胃癌中的结果是一致的。提示随着肿瘤生长肿瘤细胞一方面外侵，另一方面则出现较高概率淋巴转移。而与Aoki等[5]报道的采用常规PCR方法进行检测，CEA和CK-20与淋巴结转移无关不一致。以往大肠癌病例通过淋巴结进而导致腹膜播散未见文献报道。本试验中的3例腹膜转移阳性对照患者，肿瘤为pT3但区域淋巴结都伴广泛转移，并证实周围已经有腹膜播散。说明肿瘤细胞通过淋巴结转移进而导致腹膜播散的可能性仍存在。
近年来对于肿瘤微转移的概念发生了改变，分为两大类：①孤立性肿瘤细胞（isolate tumour cells，ITC），定义为单个，多个孤立性细胞或成簇肿瘤细胞，但直径小于0.2mm；②肿瘤微转移（mircometastases）：直径大于0.2mm肿瘤细胞团。ITC并不表现出形态学上的转移如穿透血管、淋巴窦、肿瘤细胞的增生以及基质反应，结局有可能成转移，也有可能被机体免疫所消灭[15~17]。而荧光定量PCR能够灵敏地检测出ITC。Nakanishi等[11]报道胃癌腹腔冲洗液中CEA mRNA水平是胃癌的独立预后因素。Kodera等[18]报道CK-20 mRNA水平同样也对胃癌术后生存率有重要影响，建议用CEA和CK-20共同检测肿瘤脱落细胞微转移。本研究的随访结果也看到如此倾向，手术后复发和转移的病例9例中有7例，其CEA或CK-20的水平在第一次手术时为阳性，提示腹腔冲洗液中CEA或CK-20的水平异常（特别是CEA和CK-20双阳性）是肿瘤复发和转移的高危因素。是否是大肠癌独立预后因素，有待于更长期随访。
检测肿瘤ITC的作用不限于此，也为肿瘤的治疗提供了一个新的思路。Kurebayashi等[19]在乳腺癌的动物模型，Chaudhuri等[20]在卵巢癌的动物模型，均证实微转移灶对于化疗的敏感性较大转移灶高，而Nakanishi等[21]在胃癌的腹腔转移裸鼠模型中证实：通过口服化疗制剂后，微转移灶可完全缓解甚至治愈，生存率高于腹腔大转移灶裸鼠。这就为临床治疗大肠癌提供了一个新的策略，即分子水平的诊断（CEA和CK-20）以及随后的对于具有高危因素病人的辅助化疗。近年来随着新的化疗制剂应用于大肠癌术后的辅助化疗，大肠癌的生存率有了一定程度的提高。能否将此技术与大肠癌辅助化疗结合起来，有待于今后进一步研究。
综上所述，通过实时荧光定量PCR方法，测定腹腔冲洗液中CEA和CK-20的值，显示出高于常规细胞学检查的特异性和敏感性。CEA和CK-20的值与肿瘤浸润深度、肿瘤分期以及淋巴结转移密切相关。实时荧光定量PCR测定腹腔冲洗液中CEA和CK-20是检测大肠癌腹腔微转移的有效方法。腹腔冲洗液中CEA或CK-20的水平异常与大肠癌手术后无瘤生存率密切相关，是肿瘤手术后复发和转移的高危因素。同时为临床治疗大肠癌提供了一个新的策略，即分子水平的诊断（CEA和CK-20）以及对于具有高危因素病人的辅助化疗。
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