川芎嗪对依托泊苷诱导小细胞肺癌细胞凋亡增敏作用的评判

            作者：崔丽娟 张会军 阎蕴力 阴梅云 郑力芬

【关键词】  四甲基吡嗪;,,依托泊苷;,,脱噬作用;,,流式细胞术,,,,

　　摘要：  目的：观察低浓度(10 μg/ml)的中药钙拮抗剂川芎提取物川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)与化疗药物依托泊苷(etoposide,VP16)合用对人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)细胞的影响。方法： 用MTT法观察药物对体外培养的人小细胞肺癌H446细胞存活率的影响;用吖啶橙/溴乙啶双荧光染色法检测凋亡细胞，采用流式细胞术分析药物对H446细胞周期的影响。结果： TMP和VP16合用与单用VP16相比细胞存活率明显下降,VP16的浓度在0.1、1、10、100 μg/ml时,细胞存活率分别为(93.85±2.51)%、(91.90±2.10)%、(66.64±3.73)%和(8.21±1.84)%。VP16与低浓度的TMP联用后,上述浓度细胞存活率分别降为(90.80±1.20)%、(78.96±1.94)%、(51.48±2.52)%和(2.56±1.44)%,其合并指数为0.85,增效倍数为4.32。双荧光染色法证实TMP可增强VP16的凋亡诱导作用;细胞周期分析表明低浓度TMP对细胞周期无明显影响,VP16半数抑制浓度使细胞生长停滞在S期,抑制细胞有丝分裂及DNA合成,两者合用主要表现为VP16的作用。结论： 低浓度的TMP与VP16合用可增加对小细胞肺癌细胞的诱导凋亡作用。

　　关键词：  四甲基吡嗪;  依托泊苷;  脱噬作用;  流式细胞术   

　　川芎嗪是中药川芎的有效成分之一，又称四甲基吡嗪，属酰胺类生物碱，该制剂主要应用于心脑血管疾病等［1］。近年来报道TMP与维拉帕米同样具有钙通道阻滞活性，是一种中药钙通道阻滞剂［2］，钙拮抗剂的化疗增敏效应已被广泛认同［3］。但由于这些药物增敏所需剂量过大，严重时可导致心脏毒副作用等原因，难以在临床推广应用［4］ 。而TMP临床应用多年，作用缓和，毒副作用较少。本研究应用MTT法、双荧光染色法、流式细胞术观察低浓度的TMP与临床常用的化疗药物依托泊苷合用对人小细胞肺癌H446细胞的影响，旨在为小细胞肺癌临床提供新的经验。

　　1  材料与方法

　　11  材料

　　人小细胞肺癌H446细胞株购于协和医科大学细胞库；TMP购自北京第四制药厂；VP16购自北京双鹤医药技术有限公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；吖啶橙、溴乙啶、MTT、RNA酶购自华美生物试剂公司。

　　12  方法

　　121  细胞培养  将H446细胞用RPMI1640培养基培养，内含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml，置370C，5% CO2环境下培养。每日观察细胞生长情况。

　　122  MTT法检测H446细胞存活率  根据文献所述方法进行MTT检测［3］，实验分组如下：①单用不同浓度的TMP；②单用不同浓度的VP16；③低浓度的TMP分别与不同浓度的VP16联合同时用药；④对照组加入生理盐水。以上各组细胞与药物共同作用24小时后，在全自动酶标仪上选择波长570nm测定吸光值（A值），实验重复3次，取平均值。根据A值H446细胞存活率，计算公式［3］为：

　　细胞存活率（%）=用药组A值     对照组A值×100%

　　根据各药物细胞存活率，由药物浓度的对数值与细胞存活率线性回归求出各药物的半数抑制率（IC50）［3］。应用以下公式计算出联合用药的合并指数［5］：

　　合并指数CI=联合用药IC50时的A药用量     A药单用时IC50的值+联合用药IC50时的B药用量     B药单用时IC50的值

　　当CI<0.95时表示两种药物呈协同作用；当CI>1.05时呈拮抗作用；0.96

　　增效倍数=单用化疗药的IC50     联合用疗药的IC50

　　123  吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）双荧光染色  取吖啶橙和溴乙啶各1mg，分别溶于10mlPBS(PH7.2)中，配成100μg/ml储备液，用前等量混合备用。取细胞悬液100μl,加入AO/EB混合染料4 ml混匀，滴至载玻片上，荧光显微镜下观察、照相［6,7］。实验分组同上，分别计算凋亡率。

　　124  流式细胞术  不同组别细胞经药物作用24小时后0.02%EDTA消化、离心，用冷PBS洗两次，70%乙醇固定细胞24小时。上机测定前离心去乙醇，用PBS洗两次，加100μg/mlRNase37℃消化30分钟。碘化丙锭50μg/ml染色30分钟,经尼龙网过滤后，用FACSTARCalibur型流式细胞仪测定。实验结果经计算机软件处理，计算出细胞周期的分布。按以下公式计算增殖指数［8］:
 
　　PI（%）=S+G2／M     G0／G1+S+G2／M×100%

　　125  统计学分析  细胞存活率及凋亡率结果采用t检验，细胞周期结果采用构成比的χ2检验。

　　2  结果

　　21  TMP剂量效应检测结果及非细胞毒性剂量的确定

　　经MTT方法分析表明，TMP的IC50值为175.76μg/ml；TMP浓度在0.1、1、10μg/ml时H446细胞的存活率分别为(98.62±1.22)%、(96.79±1. 46)%、(94.50±2.31)%。根据文献报告［9,10］，细胞存活率>90%,可认为该浓度下药物不具有细胞毒性，因此本实验选择10μg/ml作为增敏实验剂量，与VP16合用观察对H446细胞的抑制作用。

　　22  TMP对VP16的增敏作用

　　单用VP16时,细胞存活率随VP16浓度升高而降低，呈剂量依赖性。VP16的IC50值为47.78μg/ml。VP16与10g/mlTMP合用后,量效曲线下移, H446细胞的存活率下降,联合用药的IC50值为11.08μg/ml。药物合用与药物单用比较细胞存活率明显降低，合并指数为0.85，表明联合用药有协同作用，TMP对VP16的增效倍数为4.32。上述结果提示,低浓度的TMP对VP16有增敏作用，见表1。

　　表1  药物作用24小时后各组的存活率（略）

　　注：* 与VP16组比较，P<0.05。

　　23  TMP增强细胞凋亡作用

　　AO能透过细胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，发出明亮的绿色荧光；EB仅能透过细胞膜受损的细胞，嵌入细胞核DNA，发出橙红色的荧光。凋亡的细胞核染色增强，荧光明亮，呈均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。因此，在荧光显微镜下可见4种细胞形态：活细胞――核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞――核着绿色呈团缩状或碎裂串珠状；非凋亡的死亡细胞――核着红色并呈正常结构，即鬼影细胞；晚期凋亡细胞――核着红色呈团缩状或串珠状。高倍镜下计数20个视野，按下式计算细胞凋亡指数［7］：

　　细胞凋亡指数（%）=VA+NVA     VAN+NVNA+VA+NVA×100%

　　共计数3遍，结果取平均值。实验表明TMP能够增强VP16的凋亡诱导作用，见表2。

　　表2  药物作用24小时后各组的凋亡率（略）

　　注：* 与VP16组比较，P<0.05。

　　24  TMP 及VP16对H446细胞周期的影响

　　47.78μg/ml （IC50）的VP16作用于H446细胞后，S期的细胞显著增加，G2/M为0，说明细胞阻滞在S期阻断了有丝分裂，抑制细胞生长。该浓度的VP16加用TMP后，H446细胞周期的分布与单用VP16差异无显著性(P>0.05)；联合用药组及VP16组与对照组比较，增殖指数均下降，见表3。

　　表3  药物作用24小时后对各组细胞周期及增殖指数的影响（略）

　　注：*与对照组比较， P>0.05 ；**与对照组比较， P<0.05。

　　3  讨论

　　小细胞肺癌肿瘤细胞分化程度低，恶性程度高，且就诊时以中、晚期患者多见，手术难以完全切除。因此，化疗在SCLC的中占有重要地位。VP16是SCLC化疗常用药物，但在临床应用中，由于肿瘤组织对VP16存在敏感性差异或产生耐药等原因常导致化疗失败。近年来，发现许多化合物虽然本身不能抑制肿瘤细胞生长，但能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而可增强化疗的疗效，被称为化疗增敏剂［4］。

　　目前，研究较多的化疗增敏剂为钙拮抗剂，但由于所需剂量较大，以及较明显的心脏毒副作用限制了其在临床实际应用。因此，人们把目光投向一些传统中草药的有效成分，TMP即是其中之一，电生研究已证实TMP也是一种钙离子拮抗剂［3］。药代动力学研究证实，TMP在体内吸收完全，分布广泛，主要集中在血流丰富的组织器官，能透过血脑屏障，在血液中消除快，主要在肝脏代谢，肾脏排泄［11］。TMP已应用多年，安全性较好，临床已有大剂量应用的报告，患者耐受良好，无明显毒副作用发生［12］。

　　至今未见TMP与化疗药物合用对小细胞肺癌的抑制作用的研究报道。本实验研究表明：10μg/mlTMP与H446 细胞作用后，H446细胞生存率为（94.50±2.31）%，无细胞毒性。VP16联用10μg/ml的TMP后，量效曲线下移，H446细胞的生存率下降。TMP联用VP16与单用VP16的抑制率比较，药物合并指数为0.85，增效倍数为4.32，表明联合用药有协同作用。

　　对TMP化疗增敏机制的研究表明，TMP能抑制钙离子跨膜内流、阻止细胞内钙离子增加，妨碍钙和细胞内钙受体蛋白结合，具有钙拮抗作用。TMP的以上作用改变了与肿瘤细胞分化和增殖密切相关的钙恒稳状态［13］。

　　梁蓉等［14］的研究表明，TMP可以使HL60/VCR的bclxl基因的表达下降47%，增强细胞对VP16、阿霉素、柔红霉素、长春碱的敏感性，推测增敏作用可能与TMP的凋亡诱导有关。但TMP究竟有无增强化疗药物的凋亡诱导作用尚未进行研究。本研究采用AO/EB双荧光染色法观察凋亡，证明TMP可以增强化疗药物VP16的凋亡诱导作用，是一种有效的化疗增敏剂。

　　研究表明，化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡与细胞周期的阻滞密切相关，但是药物对肿瘤细胞周期的影响较为复杂，同一药物作用于不同的肿瘤细胞，可能产生不同的结果，深入研究这一问题将有助于合理联合应用化疗药物［15］。报告，VP16可以将肿瘤细胞阻滞在S期或G2/M期［16，17］，但化疗药物与增敏剂联合应用对细胞周期的影响如何？对这一问题目前研究较少，有些研究表明增敏剂与化疗药物联合应用对细胞周期的影响与单独应用化疗药物不同，但也有人观察到对细胞周期的影响主要以化疗药物为主。

　　本实验利用FCM分析了药物对细胞周期的影响，结果表明，低浓度TMP单用对H446细胞的细胞周期无影响，而IC50浓度的VP16组S期占总细胞周期的50.25%，显示明显增加，G2/M期均为0，说明细胞阻滞在S期，S期为细胞周期的DNA合成期，细胞阻滞在S期说明细胞的DNA合成受阻，不能进入有丝分裂期，最终导致生长受到抑制，肿瘤细胞死亡。此结果与一些文献报道一致。TMP+ VP16组S期占总细胞周期的49.63，G2/M期均为0，与单用VP16组差异无显著性，即两者联合应用主要表现为VP16对细胞周期的影响。TMP与VP16合用后细胞增殖指数低于单用VP16组。   

　　总之，TMP的化疗增敏剂机制较为复杂，可能存在多方面因素。本实验结果表明，低浓度的TMP与化疗药物合用可以获得较好的疗效，其增敏机制可能与增强化疗药物的凋亡诱导有关，为TMP作为一种化疗增敏剂用于SCLC临床治疗提供了理论依据。

　　文献

　　1  Liu CF,Lin CC,Na LT.Hepatoprotective and therapeutic effects of tetramethylpyrazine on acute econazoleinduced liver injury.Planta Med,2002,68(6):510~514.

　　2  王玉良,巴彦坤. 川芎嗪对心血管组织的药理和电生理作用一种新的"钙拮抗剂".中西医结合杂志, 1985,5(5):291~294.

　　3  李华,许才绂,黄裕新.抗癌药合用维拉帕米对体外人胃癌细胞的影响.第四军医大学学报,2001,22(9):838~842.

　　4  徐承熊,叶玉梅.癌症化疗增敏剂研究及应用进展.实用肿瘤杂志,1995,10(4):201~203.

　　5  戴体俊.合并用药的定量分析.药理学通报，1998,14(8):479~480.

　　6  Hoffmann TK,Leenen K,Hafner D,et al.Antitumor activity of protein kinase C inhibitors and cisplatin in human head and neck squamous cell carcinoma lines.Anticancer Drugs,2002,13(1):93~100.

　　7  Zisman A,Ng CP,Pantuck A,et al.Actinomycin D and gemcitabine synergistically sensitize androgenindependent prostate cancer cells to APO2L/TRAILmediated apoptosis.J Immunother,2001,24(6):459~471.

　　8  Fu YC,Jin XP,Wei SM,et al.Ultraviolet radiation and reactive oxygen generation as inducers of kerationocyte apoptosis:Protective role of tea polyphenols.J Toxicol Environ Health,2000,61 (3):177~188.

　　9  Hu YD,Qian GS.The MDR of verapamil reversing to lung adenocarcinoma A549. Cancer,1996，15(6):417~419.

　　10  Present CA,Kennedy PS,Wiseman C.Verapamil reversal of clinical doxorubicin resistance in human cancer.Br J Cancer,1986,9(4):355~364.

　　11  徐睿,李源,黄熙.川芎嗪药物代谢动力学研究进展.安徽中医学院学报,2002,21(1):58~61.

　　12  郭娟,樊玉洁,寇勇.大剂量川芎嗪治疗肺间质纤维化临床分析.临床荟萃,1995,10(11):504~505.

　　13  Wang LH,Gu SZ,Zhao BC.The effects of verapamil to the stability index of Ca in the carcinous cells of rat ascites.Oncology,1996,16(1):25~28.

　　14  梁蓉,杨平地,陈协群.等.川芎嗪对白血病HL60/VCR细胞多药耐药的逆转及其机制研究.中华血液学杂志,1999,20(6):323~325.

　　15  万永玲,吴德政.拓扑异构酶抑制剂诱导肿瘤细胞程序化死亡的研究进展.中国临床药理学杂志, 1995,11(2):119~124.

　　16  Gorzyca W,Gong J,Ardelt B.The cell cycle related differences in susceptibility of HL60 cells to apoptosis induced by various anticancer agents.Cancer Res,1993,53(13)：3186~3192.

　　17  Gorzyca W,Myron RM,Darzykiewicz Z,et al.Apoptosis of Sphase HL60 cell induced by DNA topoisomerase inhibitors:Detection of DNA strand breaks by flow cytometry using the in situ nick translation assay.Toxico Lett,1993,67(3):249~258.