皮肤血管瘤组织中细胞周期素E的阳性面积率和平均光密度的表达
作者：唐吉云 张端莲 陕声国
【关键词】 皮肤血管瘤；,,细胞周期素E；,,阳性面积率；,,平均光密度,,,,
摘要： 目的: 探讨细胞周期素E(cyclin E)在皮肤血管瘤组织中的表达及临床意义。方法：采用免疫组织化学（SP法），检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织血管内皮细胞的cyclin E表达水平，利用图像分析技术检测不同时期血管瘤和正常皮肤组织的阳性面积率和平均光密度。结果： 增生期血管瘤内皮细胞cyclin E表达水平明显高于退化期及正常皮肤组织，差异有显著性意义（P<0.01）；退化期与正常皮肤组织血管内皮细胞cyclin E表达水平差异无显著性意义（P>0.05）。结论： 血管瘤的发生、与细胞周期的调节密切相关。
关键词： 皮肤血管瘤； 细胞周期素E； 阳性面积率； 平均光密度
血管瘤是婴幼儿中发病率最高的一种以内皮细胞异常增殖为组织学特征的肿瘤。新生儿患病率为1.1%~3.8%，至1岁时可高达10%。目前成人病历也逐渐趋上升趋势。虽然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤可持续发展或其生长部位特殊而具有一定的危险性，如果位于颜面、颅内及口腔可引起明显的畸形及功能障碍，如持续发展可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症；位于颜面及口腔的血管瘤可引起明显的外观畸形及功能障碍，严重影响患者的身心健康。临床尤其对于大面积血管瘤的治疗尚缺乏确切、迅速有效的方法。虽然血管瘤各期的组织形态学特征已经通过免疫组织化学方法鉴定出来，但其发病机制尚不清楚，因此，也难以寻找到一种有效的治疗手段。细胞周期素E (cyclin E)［1］是细胞周期重要的调节因子, 细胞周期的调控与细胞增殖、分化及恶性肿瘤的发生和发展过程均有密切的联系。我们采用免疫组织化学（SP法），检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织血管内皮细胞的cyclin E表达水平，探讨细胞周期调节因子cyclin E在血管瘤发生、发展中的作用。
1 材料
11 材料来源
收集武汉大学人民病理科2002~2005年皮肤血管瘤存档蜡块50例，其中男性26例，女性24例，年龄2月~67岁，平均32.5岁。血管瘤位于头皮、眼睑、耳部、颈部、胸部、上臂、手部及大腿等部位。患者术前均未做任何辅助性治疗。
12 材料分组
蜡块切片厚5um,常规HE染色和免疫组织化学SP法检测血管瘤组织中cyclin E的表达。按Mulliken［2］分类标准将切片分组，其中增生期血管瘤24例，退化期血管瘤26例。另取瘤组织周围正常皮肤5例作为对照。
2 主要试剂
兔抗人cyclin E 单克隆抗体，通用型 SP免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸，以上试剂均购于福建迈新生物科技开发公司。
3 实验方法
31 常规 HE染色
32 免疫组织化学SP法检测cyclin E相关抗原
主要步骤：5um组织切片常规脱蜡至水。cyclin E采用高压修复抗原。3％过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，正常羊血清封闭10min以减少非特异性着色。一抗37℃孵育3h后4℃过夜。生物素标记的二抗处理15min,链霉抗生物蛋白过氧化物酶复合物处理15min。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照，人乳腺癌标本作为cyclin E阳性对照。
4 免疫组织化学结果判断
cyclin E以胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。
采用HPIAS2000型图像分析软件对cyclin E的表达进行定量分析。每张切片随机选取5个高倍镜视野（×400），测定每个视野下染色的阳性面积率和平均光密度。以每例5个视野的阳性面积率和平均光密度的平均值作为该例的测量值。
5 统计学处理
用SPSS 11.5统计软件对三组样本阳性颗粒的平均光密度和阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验，检验水准α为0.05。
6 结果
61 HE染色
增生期血管瘤组织中可见大量增生活跃的内皮细胞，内皮细胞核肥大而淡染。退化期血管瘤组织中血管内皮细胞明显减少，形成大量的毛细血管腔，血管间结缔组织增多，内皮细胞核扁平。
62 cyclin E的表达
增生期血管瘤内皮细胞核中有大量棕黄色颗粒，cyclin E表达强；退化期和正常皮肤组织中，血管内皮细胞核仅有少量棕黄色颗粒，cyclin E表达弱。 三组样本的阳性面积率和平均光密度的图像分析结果见表1。经单因素方差分析，三组样本cyclin E的表达差异有显著性意义（P<0.05）。经SNK（q）检验，增生期组与退化期组、增生期组与正常皮肤组的阳性面积率和平均光密度的差异有显著性意义（P<0.01）；退化期组与正常皮肤组上述两指标的差异无显著性意义（P>0.05）。
表1 血管瘤不同时期cyclin E表达的阳性面积率和平均光密度 (略)
注：△增生期组与正常皮肤组比较，P＜0.01；* 增生期组与退化期组比较，P＜0.01；△△退化期组与正常皮肤组比较，P＞0.05。
7 讨论
目前较为公认的观点是：血管瘤是一种血管形成性疾病。血管瘤的病程包括增生期、退化期和退化完成期三个阶段。病理表现主要为：在增生期，血管瘤内皮细胞过度增生，表现出胚胎性内皮细胞特征，瘤组织中发生稠密的新血管形成；在未知因素的控制下，血管瘤从增生期转变为退化期直至退化完成期，内皮细胞增生逐渐停止，大量内皮细胞趋向于凋亡，而原先形成的新生血管逐渐成熟并随后转向退化。国内外学者对血管瘤增生和的临床及细胞特征进行了大量研究，通过多种手段将血管瘤各期的组织形态学特征和分子标记鉴定出来，并发现了许多影响血管形成的正性和负性因子均与血管瘤的病理发展有关，同时确定了一些促进血管瘤内皮细胞异常增殖的生长因子和激素。这些成分包括多种血管形成因子、细胞外基质成分、蛋白酶及其抑制物、雌激素、自由基、NO等［3］，它们对内皮细胞迁移、分化、血管样结构形成以及细胞间的相互作用等都起着重要作用。我们在近5年的研究中，对血管瘤的发生、发展的病理机制进行了一系列研究，认为在血管瘤病理发生过程中，从增生期转变为退化期，血管瘤内皮细胞从增生到趋向于凋亡，存在着血管内皮细胞本身生理、生化和基因的异常；而血管瘤由增生向退化转变的原因则是细胞间的信号传递和内皮细胞内基因表达的改变。因此，揭示血管瘤内皮细胞从增生期转变为退化期的分子生物学机制，必将为血管瘤的防治提供一个重要的途径。
细胞周期（cell cycle）也称细胞生活周期（cell life cycle）或细胞增殖周期（cell reproductive cycle）,是指正常连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的连续动态过程。一个标准的细胞周期通常可以划分为4个连续的时相：G1期、S期、G2期和M期,其中G1期、S期、G2期合称为分裂间期（interphase）。一个亲代细胞依次经历分裂间期和分裂期后，最终形成两个遗传物质完全相同的子代细胞，完成其增殖过程［4］。
细胞周期的顺利进行依赖于细胞内外一系列活性物质对细胞内细胞周期素依赖激酶(CyclindependentKinase,CDK)活性的调节。细胞周期素依赖激酶的依次激活是细胞周期进行的关键，而细胞周期素依赖激酶的活性又受细胞周期素（cyclins）和细胞周期素依赖激酶抑制因子（CDK inhibitor，CDKI）的调控。
细胞周期素E (cyclin E) 是细胞周期重要的调节因子［5~7］,cyclin E 与特定的细胞周期依赖性激酶( cyclin dependentkinases ,CDKs) 构成复合体,可以使底物磷酸化,启动DNA 的合成, CDK 抑制蛋白( cyclindependent kinase inhibitorproteins ,CKIs) 能够抑制cyclin E 的活性。不同的物质可以通过与CKIs 之间直接或间接的相互作用影响cyclin E 的表达,这些相互作用对阐明肿瘤发生的机制是非常重要的,而且可以为大量常见的肿瘤提供预后的信息。
近年来研究表明，血管内皮细胞增殖和血管形成在血管瘤的病理演变过程中起着重要的作用。内皮细胞过度增殖、血管迅速生长是血管瘤病理组织学的最大特点［8~10］。在我们前期对血管瘤的实验研究发现，对血管瘤组织进行免疫组织化学检测，在增生期血管瘤组织中cyclinD1、cyclinB、p21的表达明显高于在退化期血管瘤组织中的表达（差异有显著性），而p15、p16在退化期血管瘤组织中的表达明显高于其在增生期的表达（差异有显著性）。
在我们的研究中发现增生期血管瘤内皮细胞cyclin E呈高表达，而退化期血管瘤内皮细胞cyclin E表达极低，正常皮肤血管内皮细胞几乎无阳性表达。显示cyclin E基因并未作为肿瘤抑制基因起作用，相反cyclin E阳性表达主要为增生期的血管瘤内皮细胞，提示cyclin E可能有促进内皮细胞的增殖的作用。cyclin E在血管瘤发生发展的作用分子机制值得进一步研究和探讨。
血管瘤内皮细胞的增殖的机制成为血管瘤发病机制研究的一个重要方面。这也与肿瘤的发生发展的机制,即细胞增殖失控、分化障碍及凋亡受阻等一致。而肿瘤的发生、发展与细胞周期的调节密切相关，因此我们希望在细胞周期调控领域来对血管瘤的发生、发展机理进行更深入的研究，找出合适的细胞周期抑制药物来抑制血管瘤内皮细胞的增殖及减少血管的形成。
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