反相高效液相色谱法测定定眩口服液中葛根素的含量

         作者： 文洪宇，陈玲，谢安永，杨娟，夏泽蓉

【关键词】  定眩口服液;葛根素;反相高效液相色谱法

　　［摘要］目的: 研究定眩口服液质量控制方法。 方法: 采用反相高效液相色谱法测定定眩口服液中的葛根素含量，色谱柱:20RBAX Extenel C18 柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相:甲醇-水（24∶76），流速:1.0mL.min。 结果: 葛根素绝对进样量在0.16～0.96μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系，y=4115.59x-42.84（r=0.9999），平均回收率为96.86%（RSD=1.84%，n=6）。 结论: 该质量控制方法可行。
    
　　［关键词］ 定眩口服液;葛根素;反相高效液相色谱法
    
　　Determination of puerarin in Dingxuan oral liquor   
　　Abstract］ Objective:To establish an RP-HPLC method to control the quality of Dingxuan oral liquor.Methods:The chromatographic system consisted of a20RBAX Extenel C18 column（4.6mm×150mm，5μm）as analytical column and methanol-water（24∶76）as the mobile phase with a flow rate of1.0mL.min.Results:The linear ranges of Puerarin was0.16～0.96μg（r=0.9999）.The average recovery was96.86%（RSD=1.84%，n=6）.Conclusions:The method can be used for quality control in production of Dingxuan oral liquor.

　　［Key words］Dingxuan oral liquor;Puerarin;RP-HPLC
      
　　定眩口服液是我院名老中医颈性眩晕的验方。中医认为颈性眩晕的病因为椎基底动脉供血不足，血行迟缓，络脉拘急，灌流锐减而致络虚不濡，脑失所养，风动于上而成。故立益气活血，通络定眩之治则，以活血通脉、解痉止痛之葛根为方中君药，补气行滞的黄芪、息风止痉的天麻为臣药，并辅以破血逐瘀、祛风通络之多味动物药组方而成。通过临床多年应用，对气虚血瘀引起的眩晕、头痛、头昏有较好疗效。本文建立了葛根主要成份葛根素的质量控制方法。

　　1 仪器与试药
    
　　HP-1100高效液相色谱仪（美国）;G1314A可变波长检测器，7725i手动进样器;METTLER AE100分析天平（上海）;葛根素对照品（含量测定用，药品生物制品检定所）;定眩口服液（30mL.瓶）由本院自制，药材由重庆市中药材公司提供，并经本院张陈炎主任中药师鉴定;试剂:含量测定中甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

　　2 方法和结果
　　
　　2.1 色谱条件
    
　　色谱柱:20RBAX Extenel C 18 柱（4.6mm×150mm，5μm）;流动相:甲醇-水（24∶76）;检测波长:250nm;柱温:30℃;流速:1.0mL.min;分离度:2.0;理论板数以葛根素峰应不低于4000。

　　2.2 溶液配制
   
　　2.2.1 对照品溶液的配制  精密称取葛根素对照品10mg，置25mL容量瓶中，加30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取2mL，置10mL容量瓶中，加30%乙醇至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得每毫升含葛根素0.08mg的对照品溶液。
    
　　2.2.2 供试品溶液的配制  精密吸取定眩口服液0.5mL，置蒸发皿中水浴蒸干，残渣加30%乙醇溶解并转移至50mL容量瓶中，加30%乙醇至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。
    
　　2.2.3 药材对照品溶液的配制  取过三号筛的野葛粉末0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30%乙醇50mL，称定重量，加热回流30min，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，再经0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得药材对照品溶液。
    
　　2.2.3 空白对照品溶液的配制  同样品定眩口服液制备方法制备缺野葛的空白样品，按“供试品溶液的配制”方法制备空白对照品溶液。

    
　　2.3 方法可行性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，结果样品中葛根素出峰时间约为6.6min，空白对照在葛根素出峰时间无色谱峰出现，表明样品中其他物质对葛根素测定无干扰。色谱图见图1。
        
　　a.葛根素对照品           b.定眩口服液供试品       c.定眩口服液缺野葛空白样品
    
　　图1 色谱图 （略）

　　2.4 线性关系考察
    
　　分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色谱仪，测定葛根素的峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=4115.59x-42.84（r=0.9999）。结果葛根素绝对进样量在0.16～0.96μg范围内与峰面积呈良好的线形关系。
    
　　2.5 精密度试验
    
　　精密吸取葛根素对照品溶液（0.08mg.mL）10μL，重复进样6次，测定葛根素峰面积，其RSD=0.33%，表明仪器精密度良好。

　　2.6 重现性试验
    
　　取同一批定眩口服液样品（批号:051024），按拟定的含量测定方法，分别制备6份供试品溶液，各精密吸取10μL进样，测定葛根素峰面积，其RSD=1.69%，说明本方法重现性好。
    
　　2.7 加样回收率试验
     
　　精密吸取同一批定眩口服液样品（批号:051024，葛根素含量4.97mg.mL）0.5mL共6份，再分别加入葛根素对照品3.0mg、2.0mg、1.0mg各2次，按拟定的含量测定方法同法制备，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定葛根素含量，回收率，结果见表1。以上6份平均回收率为96.86%，RSD为1.84%，表明本方法具有较好的回收率。

　　2.8 稳定性考察
    
　　取同一批定眩口服液样品（批号:051024）按拟定的方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24h，各精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定葛根素峰面积，其RSD=0.73%，表明供试品溶液至少在24h内稳定。

　　2.9 样品含量测定
    
　　按“药材对照品溶液的配制”方法配制并测定各批野葛葛根素含量。精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，按葛根素对照品回归方程计算，即得。五批样品测定结果见表2。

　　表1 加样回收率试验结果（略）
    
　　表2 五批样品测定结果（略）
    
　　3 讨论
    
　　定眩口服液中野葛为君药，而野葛中的有效成分葛根素具有改善脑部血液循环、保护中枢神经等作用［1］ ，与本品功效吻合，故以葛根素作为本品质量控制的指标进行方法学研究较为合理。在流动相筛选过程中，为进一步提高分离度，我们试图增加流动相极性，但样品出峰时间延长，不利于快速检测，故选择甲醇-水（24∶76）为最终确定的流动相。经方法学考察表明，该质量控制方法成立，能够控制定眩口服液产品质量。
   
　　通过样品含量测定，定眩口服液中葛根素含量随药材批次不同而波动较大，故以五批产品含量的三倍标准差结合样品平均含量，规定本品每瓶（30mL）含葛根素（C 21 H 20 O 9 ）不得少于100mg。

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　　［1］叶淑静.中药葛根研究进展［J］.浙江中医学院学报，2003，27（6）:94.