伴有染色体异常白血病患者FLT3基因突变检测的临床意义
【摘要】 本研究旨在探讨伴有染色体异常急性髓系白血病患者FLT3跨膜区内部串联重复突变检测的临床意义。用R显带染色体核型技术分析125例AML患者的细胞核型；采用PCR联合序列测定检测伴有或不伴有染色体异常的AML患者FLT3基因突变情况。结果表明： 125例患者中46例证实存在不同类型染色体异常，总检出率为36.8%，各亚型检出率分别为M0 57.14%、M1 55.56%、M2 38.71%、M3 50.0%、M4 50.0%、M5 30.77%、M6/M7 10.0%和M7 18.75%。染色体异常的类型以t(16,21)最多，为9例，占19.78%；其次分别为t(8,21)7例，占15.22%；t(4,11)6例，占13.04%。同时发现了3例国内较少见的t(6,9)染色体异常，占6.52%。无染色体异常79例患者中56例FLT3基因表达阳性，阳性率为70.89%。46例伴有染色体异常患者中31例FLT3基因表达阳性，阳性率为67.39%，两者无显著性差异(p﹥0.05)。在两组患者中FLT3/ITD基因突变阳性率分别为11.39%和24.09%，两者有显著性差异（p<0.05）。临床资料显示，伴有和不伴有染色体异常的两组患者外周血白细胞计数、Hb计数、骨髓中白细胞比例均无显著性差异(p﹥0.05)；伴有或不伴有染色体异常FLT3/ ITD阳性组绝大多数短期内死亡，两组间死亡率无显著性差异(p﹥0.05)，但伴有染色体异常FLT3/ ITD阳性组患者的生存期更短，两者有显著性差异（p<0.05）。结论：同时伴有染色体异常和FLT3/ITD突变患者预后较差，FLT3/ITD突变可以作为染色体异常AML患者预后不良的重要标志。
【关键词】 急性髓性白血病
Clinical Significance of FLT3 Internal Tandem Duplication in Acute Myeloid Leukemia with Chromosome Abnormality
Abstract This study was to explore the clinical significance of FLT3 internal tandem duplication (FLT3/ITD) in acute myeloid leukemia (AML) with chromosome abnormality. Karyotypes in 125 AML patients were analyzed by R banding technique. Using genomic PCR and sequencing, FLT3/ITD mutation in AML patients with or without chromosome abnormity were examined. The results indicated that chromosome abnormality with various types was found in 46 out of 125 samples, the positive rate was 36.8%. The positive rate in different chromosome subtypes included M0 57.14%, M1 55.56%, M2 38.71%,M3 50.0%,M4 50.0%,M5 30.77%,M6/M7 10.0% and M7 18.75% respectively. In various chromosome abnormality types, t(16,21) occurred in 9 samples with highest rate 19.78%, and the others were t(8,21) in 7 samples, t(4,11) in 6 samples with the occurrence rate 15.22%, 13.04% respectively. Besides, t(6,9) was detected in 3 samples which was seldom found domestically, the positive rate was 6.52%. In 79 samples without chromosome abnormality, FLT3 gene expression was detected in 56 samples, the positive rate was 70.89%. In 46 samples with chromosome translocation, FLT3 gene expression could be detected in 31 samples, the positive rate was 67.39%. The difference between them was no significant (p﹥0.05). And the FLT3/ITD mutation rates in these two groups were 11.39% and 24.09% respectively, whose difference was statistically significant (p<0.05). Clinical data showed that the difference was no statistically significant (p﹥0.05) in leukocyte counting and Hb assay in peripheral blood as well as leukocyte ratio in bone marrow of these two groups with or without chromosome abnormality. Most FLT3/ITD mutation patients with or without chromosome abnormality died in short time, the difference of death rate was not statistically significant between these two groups (p﹥0.05) while the life span of FLT3/ITD mutation patients with chromosome abnormality was even shorter than the other. The difference between them was statistically significant (p<0.05). It is concluded that prognosis is relatively poor in FLT3/ITD mutation patients with chromosome abnormality. FLT3/ITD mutation may be an important marker for poor prognosis of AML.
Key words AML; chromosome abnormality; Flt?3/ITD mutation; clinical significance
白血病的病因目前尚不明确。Fms样酪氨酸激酶?3（Fms?like tyrosine kinase?3, FLT3）定位于染色体13q12，属于酪氨酸激酶Ⅲ型受体。FLT3主要表达于未成熟的造血细胞、胎盘及脑中，与其他造血生长因子协同作用，共同维持干细胞、祖细胞以及抗原呈递细胞DC、杀伤细胞的生长［1］。研究发现， 30%-35%的AML患者发生FLT3/ITD突变，引起FLT3酪氨酸激酶不依赖配体持续活化，使近膜区的长度出现多态性，导致临床发生白血病［2，3］。因此，检测染色体异常AML患者FLT3/ITD突变，对阐明AML的发病机制和指导临床有极其重要的意义。
材料和方法
试剂和仪器
淋巴细胞分离液（BioLabs公司产品）、PCR试剂盒（Promga公司产品）、基因序列分析试剂盒（美国应用生物系统公司产品）、PCR引物（宝生物制品公司产品）。PCR扩增仪（ABI公司产品）、基因序列测定仪3130（ABI公司产品）。
样本来源
检测标本均来自医科大学及沈阳医学院附属血液科1998年3月至2005年10月门诊或住院治疗的AML初诊患者,并经形态学及骨髓活检确诊。125例患者中男性72例，女性54例，中位年龄13岁(3个月-61岁)。参照FAB分型标准诊断：125例患者分别为M0 7例、M1 9例、M2 31例、M3 8例、M4 18例、M5 26例、M6/7 10例和M7 16例。
染色体核型分析
治疗前抽取骨髓标本，采用短期培养法制备染色体标本，应用R显带技术进行核型分析［ 4 ］ 。每例至少分析20个中期细胞。核型易位按"人类染色体国际命名体制(ISCN 1995)"进行识别和描述。
基因组DNA的提取
患者骨髓或健康志愿者外周血标本采用淋巴细胞分离液分离单核细胞，传统酚/氯仿/异丙醇法抽提DNA。核酸蛋白测定仪测定吸光度值为2.37-2.69，调整DNA浓度为200 ng/μl。-70℃保存备用。
PCR引物设计
针对FLT3基因内部重复串联结构主要发生在11号外显子［5］，在11号外显子近端和远端分别设计引物11F和11R，扩增产物为133 bp (附图)。同时设计对照组β?actin引物actin F和actin R，扩增产物为305 bp。以上引物均由宝生物制品公司合成。引物序列为： 11F： 5'?CAATTTAGGTATGAAAGCC?3'；11R： 5'?CAAACTCTAAATTTTCTCT?3' ；actin F：5'?CTTCTACAATGAGCTGCGTG?3'；actin R：5'?TCATGAGGTAGTCAGTCAGG?3'
PCR扩增及产物测序
PCR 反应体系50 μl , 包括上、下游引物各0.2 μmol/L, dNTPs 0.25 mmol/L, Taq DNA 聚合酶2.5 U , 模板DNA 200 ng。反应条件为94℃变性3分钟后 (94℃ 1分钟, 60℃ 1分钟, 72℃ 1分钟)35个循环，最后72℃延伸10分钟。取PCR 产物13 μl，加溴化乙锭2 μl，于2%琼脂糖凝胶上电泳20分钟，PBR322 (Hind Ⅲ)作为标志物，用紫外投射仪分析图像并照相。用QIA quick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)回收纯化PCR产物，由中国刑警学院法医系测序。所得序列资料在线使用Blast进行同源性比对分析。
统计学分析
初诊患者或返院复查或信访全部资料输入机用SPSS 11.5统计软件生命表法进行统计。
Figure . Results of FLT3/ITD (+) in 21 AML patients with or without chromosome abnormality by PCR. 1-12: FLT3/ITD mutation positive of AML patients with abnormal chromosome. 13-21: FLT3/ITD mutation positive of AML patients without abnormal chromosome. 22: Control.
结 果
染色体核型分析
对125例AML患者20个中期分裂相的所有细胞进行了染色体核型分析，结果显示46例患者存在有染色体异常，总检出率为36.8%，各亚型检出率分别为M0 57.14%、M1 55.56%、M2 38.71%、M3 50.0%、M4 50.0%、M5 30.77%、M6/M7 10.0%和M7 18.75%。染色体易位的类型以t(16,21)最多，为9例，占19.78%；其次分别为t(8,21)，7例，占15.22%；t(4,11)，6例，占13.04%。同时发现国内罕见的t(6,9)染色体易位［6］3例，占6.52%（附表）。
FLT3基因表达及FLT3/ ITD基因突变
FLT3基因经PCR扩增后电泳可在133 bp位置出现特异性扩增带，如存在FLT3近膜处串连重复，则可在该条带上方多出现1条特异性条带。结果显示，125例患者中87例有FLT3基因表达，阳性率为69.6%。46例伴有染色体异常的AML患者中31例有FLT3基因表达，阳性率为67.39%；而79例不伴有染色体异常的患者中56例有FLT3基因表达，阳性率为70.89%，两者差异无显著性(p﹥0.05)。21例AML患者除FLT3基因表达外，染色体上方伴有长短不等的特异性条带，即FLT3/ITD基因突变阳性，阳性率为16.8%（附图）。46例伴有染色体异常患者中12例FLT3/ITD阳性，阳性率为26.09%；而79例不伴有染色体异常患者中9例FLT3/ITD阳性，阳性率为11.39%，两者差异有显著性（p<0.05）。碱基测序及Blast比对分析结果证实，21例FLT3/ITD阳性标本均存在有不同程度的串联重复，各例ITD的复制区域不同，长短不等(21-66 bp)，无插入序列。其余FLT3/ITD阴性标本均未见重复序列，点突变及插入（结果未显示）。
伴有或不伴有染色体异常FLT3/ ITD阳性患者临床特征
12例伴有染色体异常、FLT3/ITD阳性的AML患者外周血白细胞计数为(31.25±5.67)×109/L，Hb水平为(75.97±1.46) g/L，Plt量为(71.38±12.51)×109/L。6例患者存在不同程度肝或脾肿大，骨髓中白细胞比例为(7.91±1.28)%。而不伴有染色体易位、FLT3/ITD阳性9例患者外周血白细胞、Hb及Plt计数分别为(28.98±7.56)×109/L、(70.16±8.46) g/L及(78.59±9.42)×109/L，粒细胞平均比例为(9.28±0.56)%。3例患者存在不同程度肝或脾肿大。统计学分析显示，伴有染色体易位、FLT3/ITD阳性患者外周血白细胞、Hb和Plt计数、骨髓中白细胞比例与不伴有染色体易位、FLT3/ ITD阳性患者相比无显著性差异(p﹥0.05)。肝脾肿大发生率两者略有差异，但无临床意义。
伴有或不伴有染色体异常FLT3/ ITD阳性与临床预后的关系
12例伴有染色体异常FLT3/ ITD阳性患者平均年龄为13岁（6个月-22岁），初诊时虽接受常规化疗方案，10例在短期内死亡，死亡率为83.33%。余2例在生存随访中。10例死亡患者的平均生存时间8.9±1.5个月（3-16个月）。不伴有染色体异常9例FLT3/ ITD阳性患者平均年龄为16岁（8个月-39岁），死亡率为77.78%。平均生存时间13.9±2.39个月（8-29个月）。统计学分析显示，伴有染色体异常、FLT3/ITD阳性患者死亡率与不伴有染色体异常、FLT3/ ITD阳性患者相比无显著性差异(p﹥0.05)。而伴有染色体异常、FLT3/ITD阳性患者平均生存时间明显低于不伴有染色体异常、FLT3/ ITD阳性患者，两者有显著差异（p<0.05）。
讨 论
FLT3基因内部串联重复(FLT3/ITD)是FLT3基因突变最常发生的一种形式［7,8］。研究结果显示，目前约有19.2％-32.0%的AML患者存在有FLT3/ITD突变，而且FLT3/ITD阳性患者8年无事件生存率仅为7%［8］，提示FLT3/ITD突变是评价AML预后不良的重要指标。本研究采用R显带染色体核型技术、PCR联合DNA测序法检测了125例AML患者染色体异常、FLT3基因表达和FLT3/ITD突变情况，结果显示36.8%的患者存在不同类型染色体异常，其中无染色体异常患者FLT3基因表达阳性率为70.89%，伴有染色体易位患者阳性率为67.39%，两者无显著性差异(p﹥0.05)。但在两组患者中FLT3/ITD基因突变阳性率有显著性差异（p<0.05）。这提示了FLT3/ITD突变可能与染色体异常协同作用，在AML发生中起着重要作用。
目前，AML的发病机理尚不清楚。研究表明：FLT3/ITD突变可导致FLT3激酶的组成性激活及下游STAT5/ RAS/MAPK通路的激活［9］；TF?ⅡD抑制髓系转录因子的功能，干扰FLT3正常功能，以及激酶结构域(TDK)的20外显子点突变(PM)导致FLT3的自身磷酸化［10］ 以及FLT3突变经常与染色体异位同时发生［11］等都可以是恶性白血病发生的重要原因。本研究结果显示，虽然染色体异常、FLT3/ITD阳性患者死亡率与不伴有染色体异常、FLT3/ ITD阳性患者相比无显著性差异，但是伴有染色体异常、FLT3/ITD阳性患者平均生存时间明显低于不伴有染色体异常、FLT3/ ITD阳性患者（p<0.05），提示了Flt?3/ITD和染色体异常协同作用可能在AML预后的关系上起着重要作用。
染色体异常是恶性肿瘤最常见的分子遗传学改变，它既可使原癌基因的异常表达,也可以相邻基因融合形成新的融合基因。目前已发现的融合基因有： t(8;11)(q22;q22)异常导致的AML1?ETO融合基因、t(15;17)(q22;q11?12) 染色体易位导致的PML? RARα融合基因等［12-14］。本研究中，R显带染色体核型技术分析显示染色体异常以t(16;21)最多，为9例，占19.78%；其次分别为t(8;21)，7例，占15.22%；t(4;11)，6例，占13.04%。同时发现国内极少见的t(6;9)染色体异常3例，占6.52%，该染色体易位可导致DEK?CAN融合基因形成［6］。在本研究中的125例患者特别是4例M3患者中均未检出国内外报道中最常见的t(15;17)染色体异常，原因不明。
虽然目前AML发生、及预后不良的机制尚未完全清楚，但染色体异常和基因突变的深入研究，将为阐明白血病发病机制、诊断分型、判断其预后、寻找致病基因的药物靶点以及成功治疗白血病提供理论和实践依据。
【】
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