白膜法手工富集血小板与单供者机采血小板质量对比研究
【摘要】 本研究旨在对比白膜法手工富集血小板与单供者机采血小板的质量差异。将15袋（2单位/袋，400 ml全血制备）白膜法手工富集血小板和15单位单供者机采血小板在（22 ±2 ）℃条件下振荡保存。在制备后1小时检测血小板浓度、体积、白细胞残留量、红细胞残留量；分别在血小板保存的0、1、2、3、4、5天检测平均血小板体积、pH值、乳酸浓度、血小板膜表面CD62p表达率、凝血酶激活后CD62p再表达率、血小板低渗休克反应。结果显示：二组的血小板得率、红细胞残留量、白细胞残留量都分别达到相应的国家质量标准，但在达到相同血小板计数的情况下，白膜法手工富集血小板组的红细胞残留量、白细胞残留量明显高于单供者机采血小板组（p＜0.01）；二组的乳酸、血小板膜表面CD62p表达率均随保存时间延长而升高；二组间比较，白膜法手工富集血小板组CD62p表达率在保存0-5天均高于单供者机采血小板组（p＜0.01）。二组的pH值、凝血酶激活后CD62p再表达率均随保存时间的延长而下降；二组间比较，2-5天白膜法组pH值明显低于单供者机采血小板组（p＜0.01），0-5天白膜法组CD62p再表达率明显低于单供者机采血小板组（p＜0.01）。单供者机采血小板组血小板低渗休克反应水平在0-5天无明显变化，而白膜法手工富集血小板组血小板低渗休克反应水平随保存时间的延长而下降，保存1-5天时均明显低于单供者机采血小板组（p＜0.01）。结论：白膜法手工富集血小板质量低于单供者机采血小板质量，其制备工艺有待改进和优化，以降低红细胞、白细胞残留量和活化血小板水平，提高其血小板质量。
【关键词】 单供者机采血小板
Qualitative Comparison between Buffy?Coat?Collected Platelet Concentrates and those by Single?donor Plateletapheresis
Abstract This study was aimed to compare the difference of quality between buffy?coat?collected platelet concentrates (BC?PC) and single?donor plateletapheresis (SDP). 15 packs of BC?PC and 15 units SDP were stored at 20℃-24℃ with agitation. Platelet concentration， platelet volume, residual leukocyte and residual erythrocyte in two groups were examined after preparation for 1 hour. Mean platelet volume, pH value, hypotonic shock response (HSR) , CD62p expression and CD62p re?expression of platelet were detected on 0, 1, 2, 3, 4, 5 days of platelet preservation. The results showed that the platelet yields, residual leukocyte and residual erythrocyte in two groups accorded with the national quality standard respectively, but residual leukocyte and residual erythrocyte in BC?PC group were higher than those in SDP group when platelet yields in two groups were equal（p＜0.01）. Lactate concentration, CD62p expression of platelet increased with prolongation of preseved time, while pH value decreased gradually. Compared with SDP group, there were significant differences in CD62p expression, CD62p re?expression of platelet preserved for 0-5 days（p＜0.01）, and in pH value of platelet preserved 2-5 days（p＜0.01）.There was no changes in HSR of SDP group for 0-5 days, while HSR in BC?PC group decreased gradually. There were significant differences in HSR of platelet preserved for 1-5 days（p＜0.01）. It is concluded that the platelet concentrates prepared by BC?PC are not equal to SDP in quality, the preparation technology of BC?PC should be optimized further in order to reduce residual leukocyte, residual erythrocyte and activated platelet yields, as well as improve the quality of BC?PC.
Key words single?donor plateletpheresis; buffy coat; hypotonic shock response; CD62p
J Exp Hematol 2007; 15(4):878-881
随着全自动血细胞分离机在国内的普及推广，我国单供者机采（单采）血小板的用量逐年上升，而手工白膜采集的血小板在临床的应用越来越少，造成手工采集全血中血小板资源的严重浪费。而在欧洲，手工采集的血小板始终占血小板用量的大多数。
国家卫生部决定自2006年9月30日起，一律停止有偿单采血小板。因此临床供应的单采血小板数量显著下降，手工制备浓缩血小板的用量稳步上升。目前国内多数血站提供的浓缩血小板是采用白膜法手工制备，我们对白膜法手工富集血小板与单采血小板的质量与保存效果进行对比研究，为改进手工采集浓缩血小板工艺和建立全面质量标准提供依据。
主要仪器与应用试剂
MCS+血细胞分离机和995E采集保存袋（美国血液技术公司产品），四联血液采集保存袋（广州华南医疗用品有限公司产品），Heraeus 6000i 低温离心机（德国贺利氏仪器公司产品），MEK?6180 K 型血细胞计数仪（日本Nikonkohden 公司产品）,VITROS 950干化学全自动生化分析仪(美国强生公司产品)，FACSCalibur 流式细胞仪(Becton Dickinson产品) 和CellQuest 分析软件，APACT2聚集仪（四川美生实业有限责任公司产品），血小板振荡保存箱（美国Forma公司产品），HI9321 微电脑型pH 计(Hanna 公司产品)，37℃恒温水浴箱（北京长安仪器厂产品），Negeotee 血细胞计数池（Hausser Scientific Horsham, USA产品）,普通光学显微镜（日本Olympus公司产品）。抗CD61 抗体: PerCP 标记(Becton Dickinson产品)；抗CD62p 抗体: RPE 标记( PharMingen公司产品)；人凝血酶: 0.5 U/ ml (Sigma公司产品)； Gly?Pro?Arg?Pro 乙酸盐( GPRP) : 25 mmol/ L ( Sigma 公司产品)；改良TBS缓冲液: (NaCl 137 mmol/ L; KCl 2. 8 mmol/ L; MgCl21 mmol/L; NaHCO3 12 mmol/ L)； HEPES液1 mol/L。
血小板的制备与保存
选择符合国家献血标准的健康献血者30名，外周血血小板计数均大于1.5×1011/L，采血前1周未服用阿司匹林、消炎痛等已知对血小板功能有影响的药物，其中15名使用四联血袋(ACD?B抗凝剂)采集全血400 ml。全血在采集后的6小时内制备成浓缩血小板。制备流程：使用Heraeus 6000i 低温离心机，第1次 1861×g 离心16分钟，把上层血浆分出200 ml至血浆袋，分约50 ml血浆至转移袋，再挤出20 ml混有红细胞的白膜层，血浆冲管至终体积约90 ml；第二次 391×g 离心6分钟；分出上层富血小板血浆50-70 ml（记为2单位）至第四联袋（PVC血小板专用保存袋），下层红细胞丢弃。另15名献血者使用MCS+血细胞分离机、995E保存袋采集血小板和ACD?A抗凝剂，单采容量为250-270 ml，血小板记数大于2.5×1011/单位。将所得浓缩血小板和单采血小板均置于血小板振荡保存箱内，于22±2℃振荡保存，振荡频率为60次/分钟。
样本的制备和处理
将浓缩血小板和单采血小板轻摇混匀后，在无菌操作台上留取样品至2支塑料试管中；将其中1支试管以 1007×g 离心10分钟后取其上清液即为乏血小板血浆（PPP），用PPP与另一支试管中的血小板以（1-3）∶1的比例混合配制成浓度为（3-4）×1011/L的富血小板血浆（PRP）待用。
血小板产品中的血小板、红细胞测定
将稀释后PRP混匀后用MEK?6180 K型血细胞计数仪测定血小板量、MPV及RBC。实际血小板数= 血小板计数/ L ×稀释倍数 ×血小板容量(L)；每袋血小板中红细胞数=红细胞计数/ L ×稀释倍数 ×血小板容量(L)。
血小板产品的白细胞计数
用Negeotee血细胞计数池计数白细胞, 取100 μl混匀的血小板样品与400 μl白细胞稀释液混合10分钟,充池,然后将计数池置于附湿滤纸的培养皿内加盖,静置20分钟后将计数池置于200倍双目显微镜下计数白细胞。每袋血小板中白细胞混入量= 白细胞数/ L ×血小板容量。
pH值、乳酸的测定
采用无菌注射器留取血小板样品2 ml，1 ml立即上HI9321微电脑型pH 计测定pH值，而另1 ml用VITROS 950干化学全自动生化分析仪测定乳酸浓度。
低渗休克反应测定（HSR）［1，2］
APACT2聚集仪开机、预温, 将等渗PBS 缓冲液和低渗去离子水置于聚集仪预温孔内预温。使用HI9321 微电脑型pH 计测定PRP的pH之后，并用1.0 mol/L的HEPES液调节PRP的pH约为7.0。预温完成后，在1测试杯中加入200 μl PPP, 置于测试孔中设定PPP值后取出, 在另1测试杯中加入200 μl PRP, 放入搅拌棒后插入测试孔中设定完PRP值后, 取200 μl 等渗PBS 缓冲液迅速注入此测试杯中, 立即启动检测, 并记录聚集仪在0. 5分钟时的透光率，记为TPBS; 用低渗去离子水代替等渗PBS 缓冲液重复以上操作, 并记录凝集仪在4分钟内的最大透光率及4分钟时的透光率，分别记为TMAX和T4min。
HSR=［（TMAX-T4 min）/（TMAX-TPBS）］×100%
血小板CD62p的阳性率与凝血酶激活后CD62p再表达率测定
在FCM专用试管中依次加入PRP，2.5 mmol/ L的GPRP、CD61、CD62p 各5 μl，TBS 35 μl，轻轻摇匀后室温避光孵育15分钟；CD62p再表达率测定时，在加入CD62p之前需加入0.5 U/L的人凝血酶，混匀后再加CD62p 5 μl，TBS 30 μl，37℃避光孵育15分钟。加入4℃ 1%的多聚甲醛500 μl，避光固定15分钟，24小时内进行FCM分析。对照设定：单纯血小板对照，单染PerCP标记抗CD61抗体对照，单染RPE标记抗CD62p抗体对照，用于调补偿。CD62p再表达率=凝血酶激活后CD62p的阳性率-CD62p的阳性率。
统计学处理
所得数据以平均数±标准差（±SD）表示，各参数差异比较用配对t检验。
结 果
两组血小板制备后常规质量指标检测
结果见表1。两组血小板均分别达到了国家质量标准。12单位手工制备浓缩血小板相当于1单位单采血小板，血小板总数与单采血小板组比较无显著差异（p＞0.05），而白细胞残留总数、红细胞残留总数、血小板总容量明显高于单采血小板组（p＜0.01）。
两组血小板液态保存过程中代谢、功能指标的变化
结果见表2。随着保存时间的延长，两组的乳酸浓度均逐渐增高，pH值逐渐下降；2组间比较，0-5天乳酸浓度均无显著差异，0-1天pH值无显著差异，2-5天白膜法组pH值低于单采血小板组（p＜0.01）。2组的MPV均随保存时间延长而增大，在0-4天两组间无显著差异，第5天白膜法手工富集血小板组的MPV明显高于单采血小板组（p＜0.05），单采血小板在整个保存期间HSR无明显变化，白膜法手工富集血小板组第2天开始出现明显下降，与单采血小板组比较差异显著（p＜0.01）。随保存时间的延长，CD62p表达率不断升高，CD62p再表达率不断下降，2组间比较差异显著（p＜0.01）。
讨 论
单采血小板的国家质量标准为每单位单采血小板的血小板计数≥2.5×1011，白细胞混入量≤5×108，红细胞混入量≤8×109；手工制备浓缩血小板血小板计数≥4.0×1010（2单位/400毫升全血制备），白细胞混入量≤5×108，红细胞混入量≤2×109［3］。本实验中的单采血小板与手工制备浓缩血小板均达到了相应的质量标准，但按照血小板计数，输注12单位手工制备浓缩血小板才相当1单位单采血小板，而红细胞残留总数、白细胞残留总数、血小板容量则明显要高于单采血小板（p＜0.01），引起输血不良反应的几率可能也会相应增大。
血小板在体外液态保存过程中，新陈代谢活动仍在不断进行中，主要包括有氧代谢和糖酵解两种途径［4］。血小板的能量供应主要源于有氧代谢，其代谢终产物二氧化碳可以通过血小板保存袋扩散出去。糖酵解的终产物是乳酸和氢离子，无法通过保存袋扩散，氢离子被血浆中的碳酸氢盐缓冲，但当乳酸达到20 mmol/L时，血浆的缓冲作用消失，导致pH值迅速下降［5］。因此，pH值作为血小板质量监控的一项重要指标而被大多数血液机构采用。本研究中两组血小板的pH值均随保存时间延长而下降，但白膜法手工富集血小板组pH值下降更明显（p＜0.01），因而可能对其体外功能产生不利影响。
血小板CD62p，也称P选择蛋白，是血小板活化的重要标志物之一，CD62p表达率是目前可以有效预测血小板体内回收率和存活率的最佳指标［6,7］。欧阳锡林等［8］研究表明，凝血酶激活后CD62p再表
达率可以有效反应血小板保存过程中功能储备的变化情况。本研究同时对两种方法制备血小板制备后及保存过程中CD62p表达率及凝血酶激活后CD62p再表达率进行了监测，结果随保存时间的延长，CD62p表达率不断升高，CD62p再表达率不断下降，究其原因可能主要是血小板储存损伤所致。但白膜法手工富集血小板组CD62p表达率的基础值明显高于单采血小板组，而CD62p再表达率基础值明显低于单采血小板组，其原因可能是白膜法制备浓缩血小板过程中2次离心、挤压白膜等制备工序造成血小板过度激活所致。
HSR是能反映血小板体内存活率的重要功能指标［1］，HSR的恢复率越高，血小板的形态与体积就越接近正常，血小板的功能就越好。本研究中两组的MPV均随保存时间延长而增大，在0-4天两组间无显著差异，第5天白膜法手工富集血小板组的MPV明显高于单采血小板组；单采血小板在整个保存期间HSR无明显变化，而在白膜法手工富集血小板组第2天开始出现明显下降，与单采血小板组比较差异显著。HSR的变化间接反映了血小板膜耗能被动转运能力的变化，受保存介质中能量代谢水平、pH值的影响。pH值的下降可能造成能量代谢及血小板膜转运系统酶活性下降，从而使血小板HSR能力降低。
综上所述，白膜法手工富集血小板质量低于单采血小板质量，其制备工艺尚需进一步改进和提高，以降低红细胞、白细胞的残留率和活化血小板水平，全面提高手工制备浓缩血小板的质量。
【】
1Holme S, Moroff G, Murphy S, et al. A multi?laboratory evaluation of in vitro platelet assays: the tests for extent of shape change and response to hypotonic shock. Transfusion, 1998; 38: 31-40
2邬旭群, 熊文, 鲍自谦等. 血小板低渗休克反应检测方法的建立及应用. 检验医学杂志,2006; 21:6-8
3中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. 全血及成分血质量要求（ GB 18469?2001）. 北京：标准出版社. 2001：1-14
4Cardigan R, Turner C， Harrison P. Current methods of assessing platelet function: relevance to transfusion medicine. Vox Sang, 2005; 88：153-163
5Murphy S. Platelet storage for transfusion. Semin Hematol, 1985; 22:165-177
6 Dumont LJ, AuBuchon JP, Whitley P, et al. Seven?day storage of single?donor platelets: recovery and survival in an autologous transfusion study. Transfusion, 2002; 42:847-854
7 欧阳锡林，刘景汉，石群等. 优化流式细胞术测定保存血小板CD62p表达. 中国实验血液学杂志, 2002 ; 10 :462-465
8欧阳锡林，刘景汉，高大勇. 流式细胞术测定保存血小板再表达CD62p方法的建立及应用. 中国输血杂志，2002； 15:77-81
