NF－κB活化及WT1、MDR1的表达在急性非淋巴细胞白血病中的临床意义
【摘要】 本研究通过观察初治与难治急性非淋巴细胞白血病中NF?κB活性及WT1、MDR1的表达水平，探讨三者在急性非淋巴细胞白血病疗效中的作用与相互关系，为寻找新的改善难治急性非淋巴细胞白血病疗效的方法提供理论依据。急性非淋巴性白血病患者45例，其中初治组20例（A组），难治组25例（分为B、C两组）。以15例单纯缺铁性贫血患者作为对照组。采用凝胶电泳迁移分析（EMSA）法检测各组病人NF?κB的活化水平，用逆转录多聚酶链式反应（RT?PCR）法检测各组病人WT1及MDR1的表达水平。结果发现，在对照组未检测到NF?κB活化及WT1和 MDR1表达；在初治组中NF?κB的活化水平、WT1和 MDR1表达水平均明显低于难治组，而在难治B、C两组中三者无明显区别；各组病人细胞中NF?κB活化水平与WT1及MDR1的表达水平呈正相关。结论：NF?κB的活化，WT1、MDR1的高表达可能是急性非淋巴细胞白血病难治的原因之一，急性非淋巴细胞白血病中NF?κB的活化水平与WT1、MDR1的表达呈正相关。
【关键词】 NF－κB；WT1；MDR1；急性非淋巴细胞白血病
Clinical Significance of NF?κB Continual Activity and Expression of WT1 and MDR1 in Acute Nonlymphocytic Leukemia
Abstract The study was aimed to explore the NF?κB continual activity and the expression of WT1 and MDR1 in acute non?lymphocytic leukemia(ANLL) patients, and to investigate if the three factors affect the curative effect of ANLL together as to provide some theoretical basis for finding new measures to improve the curative effect of refractory ANLL. The bone marrow samples of 45 ANLL patients was collected. 45 patients including 20 primary ANLL patients (A group) and 25 refractory ANLL patients. Refractory ANLL patients were divided into 2 sub?groups (B, C groups). The primary patients who was no effect after more than two courses of treatment were taken as group B, and the patients with more than two relapses were taken as group C. At the same time , 15 patients with simple iron deficiency anemia were collected as negative control. The NF?κB continual activity was measured by using electrophoretic mobility shift assay（EMSA） and the expressions of WT1, MDR1 were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT?PCR). The results showed that the activity of NF?κB and the expressions of WT1, MDR1 were not detected in 15 samples of simply iron deficiency anemia subjects. The NF?κB continual activity ,the expression levels of WT1 and MDR1 in the refractory group were significantly higher than that in primary group（P<0.001）. But the NF?κB continual activity, the expression of WT1 gene and MDR1 gene were not significantly different between group B and group C (P>0.05). By assaying the relativity between the them the NF?κB continual activity and the expression of WT1 or MDR1 had positive correlation in ANLL patients. It is concluded that the NF?κB continual activity, the overexpression of WT1 and MDR1 may be one of the reasons causing poor curative effect in acute non?lymphocytic leukemia. The NF?κB continual activity and the expression of WT1, MDR1, all show positive correlation in ANLL patients.
Key words NF?κB；WT1；MDR1； acute non?lymphocytic leukemia
近些年NF?κB在许多领域受到关注。研究提示，NF?κB的异常表达与白血病有一定的相关性，并认为NF?κB激活是促成白血病细胞存活的一个重要因素［1］。在WT1、 MDR1基因启动子内均含有NF?κB结合位点，因而WT1、MDR1基因有可能成为NF?κB的下游靶基因。本研究观察急性非淋巴细胞白血病中NF?κB的活化水平及WT1、MDR1的表达水平； 研究NF?κB的活化与WT1和MDR1在急性非淋巴细胞白血病中的表达水平是否相平行，旨在探索NF?κB与WT1及NF?κB与MDR1之间的关系，以明确难治急性非淋巴细胞白血病疗效欠佳是否因为NF?κB活化与WT1及MDR1高表达所致，从而为寻找新的改善难治急性非淋巴细胞白血病患者疗效的方法提供理论依据。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)NF?κB活化及WT1、MDR1的表达在急性非淋巴细胞白血病中的临床意义材料和方法
研究对象
急性非淋巴性白血病患者45例，其中初治组20例，难治组25例。对照组15例，均为单纯缺铁性贫血患者。所有骨髓标本均来源2004年6-12月湘雅门诊和住院的患者。
诊断及纳入标准
初次确诊均根据临床表现、外周血涂片、骨髓细胞形态学检查、细胞组织化学染色等综合指标，并参照FAB诊断标准进行确诊。经1个标准疗程化疗后部分或完全缓解的初治病人纳入初治组（A组）；≥2个标准疗程化疗无效的初治者，纳入难治B组；≥2次复发者纳入难治C组。单纯缺铁性贫血的诊断标准依据张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》［2］。难治的判断标准依据邓家栋主编的《临床血液学》［3］。
试剂
EMSA试剂 BCA蛋白定量试剂盒为碧云天公司出品，EMSA试剂盒为pierce公司产品，lot number:20148。
RT?PCR相关试剂 焦碳酸二乙脂（DEPC）、人淋巴细胞分离液（比重1.007±0.02）均为北京鼎国生物技术有限责任公司产品；TRIzoL、 RevertAidTM First Strand cDNA Systhesis Kit、GeneRulerTM 100 bp DNA ladder为Fermentas公司原装；TaqDNA聚合酶为 Promega公司原装；琼脂糖产自西班牙，分装；无水乙醇、氯仿、异丙醇由湘雅药剂科提供，均为国产分析纯试剂。
骨髓单个核细胞分离
无菌操作取骨髓8 ml，肝素（50 U/ml）抗凝，用等体积PBS液稀释混匀，缓慢加入等体积人淋巴细胞分离液，2 000rpm, 离心15分钟，取界面层骨髓单个核细胞（MNC），用PBS液洗涤2次，在显微镜下计数，台盼蓝拒染率大于99％。于同一标本中，取约2×107个细胞，-70℃冻存，用于提取核蛋白；另取约3×106个细胞，加TRIzoL试剂1 ml，充分混匀之后，-20℃冻存，用于提取RNA。
NF?κB活化检测
应用EMSA方法进行NF?κB活化检测［4］，主要步骤包括：①核蛋白抽提和浓度测定；②双链寡核甘酸探针制备：设计NF?κB特异结合探针， sense：5′?AGT TGAGGGGACTTTCCCAGGC?3′；antisonse：3′?TCA ACTCCCCTGAAAGGGTCCG?5′；生物素进行5′端标记（上海博亚）；③DNA结合蛋白的凝胶电泳迁移测定（gel shift assay）。DNA/蛋白结合反应：依次加入核蛋白5 μg,加水至20 μl,室温下放置20分钟,加12p?探针2 μl,室温下放置30分钟；上样,电泳（电压120 V）， 1小时,转膜（100 V） 45秒，紫外交联10秒；④生物素自显影；⑤在图像分析处理系统上分析蛋白结合性（灰度面积值）。
WT1，MDR1表达水平检测
用RT?PCR方法进行WT1，MDR1表达水平检测。主要步骤包括：①细胞总RNA的提取；②PCR引物设计［5-7］：分别设计WT1、MDR1、β?actin引物序列。WT1：上游引物：5′?GGCATCTGAGACCAGT GAGAA?3′， 下游引物：5′?GACACTCAGACTTGAA AGCAGT?3′， 扩增产物片段481 bp；MDR1：上游引物：5′ ?CCCATCATTGCAATAGCAGG?3′ ， 下游引物：5′?GTTCAAACTTCTGCTCCTCA?3′ ，扩增产物片段157 bp；β?actin：上游引物：5′?CGCTGCGCT GGTCGTCGACA?3′， 下游引物: 5′?GTCACGCAC GATTTCCCGCT?3′，扩增产物片段619 bp；③cDNA的合成；④PCR扩增：条件如下，WT1：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，51℃退火60秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃延伸10分钟。MDR1：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸70秒，27个循环，72℃延伸10分钟；⑤PCR产物分析：PCR产物于1.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳条带，Tanon GIS凝胶图像处理系统扫描并读取光密度值，将WT1或MDR1与β?actin的光密度比值作为mRNA的相对表达量。各标本重复2次，取平均值。
统计学处理
结果用均数±标准差（±SD）表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson分析法。所有数据均用SPSS 12.0统计软件处理，以P<0.05为差异有显著性标准。
结 果
急性非淋巴细胞白血病中NF?κB的活化水平及WT1、MDR1基因的表达水平
NF?κB在急性非淋巴细胞白血病中的活化水平 用EMSA法检测各标本内NF?κB的活化水平，其中较为典型标本的检测结果如图1所示。由图1可以看出，电泳速度最快的为浓黑的标记探针自由带,标记探针与核蛋白结合后,出现深浅不一的DNA/蛋白质(NF?κB)结合带。结合带着色越深、灰色面积越大,则NF?κB的活性越高。特异性竞争结合带(NF?κB带)消失,表明该探针与核蛋白的结合是特异的。在对照组未见DNA/蛋白质结合带；难治组与初治组比较，前者DNA/蛋白质结合带的着色及灰色面积，明显比后者深且宽（图1,表1）。
急性非淋巴细胞白血病WT1,MDR1基因表达 检测结果显示：在对照组未检测到WT1,MDR1;初治组及难治组的WT1,MDR1表达水平明显增高，且在难治组明显高于初治组。而难治B、C两组间无明显差别（表2）。各组病例中较为典型标本电泳见图2，3。由图2、3可见两者也无明显不同。
讨 论
NF?κB作为众多基因转录的调节因子,通过与其他转录因子的协同作用,在转录水平上形成复杂的基因调控,产生抗凋亡、促增殖、促转移的作用。它是由Rel蛋白家族中的成员以同源或异源二聚体形式组成的一组转录因子，一般非激活状态下NF?κB与IkB结合存在于胞浆中，当细胞受到外界因素刺激后，IkB磷酸化并迅速降解，NF?κB被释放、激活。近年来研究发现,多种致癌因素和临床上应用的多种细胞因子和化疗药物，可以激活NF?κB,激活的NF?κB进入胞核内与相应的kB位点相结合，激活特异靶基因的转录。
WT1基因最早发现与Wilms瘤发生、有关。它具有抑制肿瘤和激活基因转录的双重功能，在白血病和各种实体瘤中，它主要发挥致癌基因作用［8］。人的WT1启动子内含有NF?κB结合位点，因而WT1有可能成为NF?κB的下游靶基因之一。激活的NF?κB进入细胞核内可以与WT1启动子内的NF?κB结合位点结合进而调控WT1的转录［1］。本试验结果显示：在对照组中未检测到NF?κB 和WT1；初治组及难治组患者NF?κB活化，WT1表达明显升高；难治组中两者显著高于初治组，说明NF?κB 和WT1与急性非淋巴细胞白血病的发病及疗效有关，提示NF?κB活化水平及WT1的表达水平愈高，急性非淋巴细胞白血病的预后愈差 。而且NF?κB的活化可能导致了WT1转录水平增高，本实验同时观察到各组病人NF?κB的活化水平与WT1的表达呈正相关也可解释这一点，这说明在急性非淋巴细胞白血病中NF?κB 的活化水平与WT1的表达水平是相平行的。
难治性急性白血病疗效差多因化疗耐药或残留白血病所致。肿瘤耐药存在很多机制，凋亡受阻是肿瘤细胞产生耐药性的主要原因之一，而NF?κB在肿瘤中的抗凋亡作用已被大量试验所证实［9］。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，激活了NF?κB。Bentires等［10］证实，多药耐药基因(MDR1)启动区域的第1外显子包含1个纯化的NF?κB结合序列，所以激活状态的NF?κB与MDR1中的NF?κB结合序列结合促进MDR1转录。而MDR1编码p?gp表达，可以通过自身膜蛋白泵作用外排多种化疗药物，减少肿瘤药物的吸收而导致耐药［11］。实验结果显示，15例对照组病人均未检测到NF?κB及MDR1。20例初治患者中仅2例MDR1表达阳性，13例NF?κB活化，且活化水平明显高于对照组。初治患者中MDR1的表达说明，MDR1过度表达并不完全依赖于化疗药物的长期诱导，可能与白血病的遗传异质性有关，提示ANLL存在内在耐药，这一部分病人往往化疗效果较差。难治组中NF?κB的活化水平与MDR1表达水平明显增高，究其原因可能是：①难治组患者本身致癌因素作用较初治组强，加之化疗药物的作用，大量NF?κB被激活；②激活状态的NF?κB可与MDR1启动区域NF?κB的结合位点结合，调控MDR1的转录，使MDR1的表达增高；③化疗药物本身诱发了多药耐药，致使MDR1表达增高。激活状态的NF?κB可使白血病细胞凋亡受阻，而MDR1高表达导致难治急性非淋巴细胞白血病耐药。本研究中难治组患者一部分是经≥2次标准疗程化疗未缓解的初治者，另一部分是缓解后≥2次复发者。两者中NF?κB的活化水平与MDR1的表达水平无明显区别，提示原发耐药与继发耐药患者中NF?κB活化水平及MDR1表达水平无明显差异。
本研究观察到NF?κB的活性水平与WT1及MDR1表达水平在急性非淋巴细胞白血病中呈正相关，但NF?κB的活化是否直接促进了WT1及MDR1的高表达还有待进一步研究。但有这种可能，即在急性非淋巴细胞白血病中NF?κB的活化促进了WT1和MDR1的表达，从而对白血病细胞起了一定的抗凋亡、促增殖作用，并且致肿瘤细胞耐药，而使白血病的难治。因此，NF?κB活化水平增高很可能是导致急性非淋巴细胞白血病难治的一个主要原因，故推想应用NF?κB抑制剂可能会减少WT1及MDR1的表达，从而促进白血病细胞的分化，并增敏化疗药物的抗肿瘤作用，提高化疗疗效。众多实验已验证，应用抗氧化剂如乙酰半胱氨酸(NAC),或将NF?κB的反义核苷酸、含κB顺式结合序列的引诱物(decoy)导入白血病干细胞,均可抑制NF?κB的活化,增进肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性,促进瘤细胞的凋亡［12］。这提示临床中可以考虑在化疗的同时加用NF?κB抑制剂。
【】
1段卫明，陈子兴.WT1介导的转录调控通路与白血病.实验血液学杂志，2002;10：366-370
2张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第二版.北京:出版社，1998:10-15
3邓家栋主编.临床血液学.上海:上海科学技术出版社,2001:988
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