核糖体蛋白L6对K562/A02细胞耐药性及凋亡的影响

             作者：陈宏 谢兆霞　姜浩 张志伟 王光平 

【摘要】  　　本研究观察核糖体蛋白L6(RPL6)基因表达的改变对白血病细胞耐药性的作用及其可能的机制。通过RT?PCR 方法获得RPL6cDNA序列，用真核表达载体pcDNA3.1（+）分别构建正向插入和反向插入的RPL6 cDNA 重组质粒。以脂质体将正义RPL6 cDNA 真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562/AO2细胞。以MTT、流式细胞术和荧光分光光度计观察RPL6对化疗药物耐药性、凋亡和caspase?3的作用。结果表明：　转染正义RPL6cDNA 真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性增强到原来的325%，凋亡和caspase?3活性明显降低（P<0.005）；转染反义RPL6 cDNA 真核表达质粒后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药性降低原来的38%；凋亡和caspase?3活性明显增加（P<0.005）。结论：　RPL6基因过表达通过改变药物诱导的凋亡在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。

【关键词】  核糖体蛋白L6； 　抗药性；　细胞株　 K562/A02

　　Effect of Ribosomal Protein L6 on Drug Resistance and Apoptosis in K562/A02 Cells   

     Abstract    The objective of study was to investigate  the effect of ribosomal protein L6 (RPL6) gene expression on the drug resistance of leukemia cells and its possible mechanism.  RPL6 cDNA was obtained by RT?PCR, both sense and antisense cDNA recombinants of RPL6?encoding gene were constructed with pcDNA3. 1(+) expression vector. Subsequently , the sense RPL6 cDNA recombinant was transfected into K562 cells while the antisense one into K562/A02 cells by liposomal reagent. The chemosensitivity,  apoptosis and caspase?3 activity of K562 and K562/A02 cells were evaluated by MTT assay,  flow cytometer and fluorometer respectively.  The results indicated that  expression of RPL6 in K562/A02 was higher than that in K562; resistance  of sense?transfected K562 cells to doxorubicin was 325% of control cells, apoptosis and caspase?3 activity decreased (P<0.005); whereas resistance  of antisense?transfected K562/A02 cells to adriamycin was 38% of control cells, apoptosis and caspase?3 activity significantly increased (P<0.005). It is concluded that  RPL6 gene plays an important role in the development of drug resistance in K562/A02 cells by changing drug?induced apoptosis.

    Key words    Ribosomal protein L6; 　Drug resistance; 　Cell line;  K562/A02

    J Exp Hematol 2007; 15(2):292-295

    白血病生存期短，病死率高，其主要原因之一是多药耐药（multidrug resistance， MDR）的产生。MDR 机制复杂，如以P?糖蛋白为代表的膜泵蛋白的表达、细胞解毒能力的增强、DNA修复能力的增强、拓扑异构酶的改变、蛋白激酶C各种同工酶的改变等等，不能完全解释MDR产生的原因。核糖体蛋白L6（ribosomalprotein L6, RPL6）可能在人T细胞白血病病毒?I的生活周期中发挥作用，参与细胞损伤后的再生，促进细胞的增殖。报道，RPL6在某些耐药细胞表达增高［1］，是否涉及肿瘤多药耐药，报道不多，为此，我们做进一步的探讨。

    材料和方法

    细胞和试剂

    K562/A02细胞引自医学院天津血液病研究所, K562细胞由中南大学湘雅医学院分子生物学教研室罗志强教授惠赠。引物由上海博亚生物工程公司合成，逆转录酶、pGEM?T Easy载体为Promega公司产品，胎牛血清购于杭州四季青公司，TRIZOL、 RPMI 1640培养液为Gibcol公司产品，脂质体转染试剂盒、pcDNA3.1(+)载体为Invitrogen公司产品，T4DNA连接酶，限制性内切酶，dNTP、Taq酶、DNA胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品,JM109菌种为本研究室保存。K562细胞和K562/A02细胞培养于含10%的灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中,置37℃, 5 % CO2培养箱中培养。K562/A02细胞以0.8 μg/ml阿霉素维持耐药性，在停药2周后进行实验。

   RPL6在K562/A02细胞的表达和克隆 收获5×106细胞，用TRIZOL试剂盒提取细胞总RNA ,检测其完整性、纯度和浓度。

    cDNA的逆转录(RT)合成  取总RNA 1 μg, 70℃变性10分钟，冰上置5分钟，再加入10×buffer 2 μl、25 mmol/L MgCl2 2 μl、dNTPs 2 μl、RNA酶抑制剂20 U、Oligo(dT)15 1 μl、AMV逆转录酶15 U，总体积为20 μl，42℃反应60分钟，95℃灭活5分钟，冰上骤冷。

    PCR扩增   RPL6: 上游引物: 5′? ATGGCGGGTGAAAAAGTTG?3′，下游引物: 5′?CATTTAGAACACCAATTTGTGAGG?3′, 目的片段870 bp;β?actin：上游引物5′?ACCGTGGAGAAGAGCTACGA?3′，下游引物: 5′?GTACTTGCGCTCAGAAGGAG?3′，长度309 bp。RT产物3 μl，加入10×buffer (含Mg2+)3 μl、dNTPs 3 μl、RPL6、内参引物各1 μl、Taq酶1 μl,反应体系30 μl。扩增条件为： 94℃变性5分钟，94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 60秒，35个循环，72℃延伸10分钟。

    测序  用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。将PRL6基因的PCR产物与pGEM?T Easy 载体进行快速连接反应, 然后转化感受态大肠杆菌,根据蓝白筛选挑出阳性克隆、扩增细菌、碱裂解法提取质粒。经限制性酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司进行DNA测序。

    PRL6 cDNA真核表达质粒的构建

    对含PRL6 cDNA 的pGEM?T Easy 质粒和pcDNA3.1(+)真核表达载体分别用Ecor Ⅰ酶切,电泳后割胶回收目的基因片段和线性pcDNA3.1(+)载体,过柱纯化。线性pcDNA3.1(+)载体与RPL6 cDNA进行连接反应,然后进行细菌转化、挑选阳性克隆、扩增细菌、提取质粒。以KnpⅠ酶切鉴定。

    细胞对阿霉素敏感性的MTT法测定

    转染操作按说明书进行。实验分为6组： K562细胞组、空载体pcDNA3.1(+)转染K562细胞组（eK562）、正义转染PRL6 cDNA真核表达质粒的K562细胞组（sK562）及K562/A02细胞组（K562/A02）、空载体pcDNA3.1(+)转染K562/A02细胞组（eK562/A02）、反义转染PRL6 cDNA 真核表达质粒的K562/A02细胞组（aK562/A02）。细胞转染成功后,接种至96孔培养板上, 以阿霉素进行MTT实验, 每组设3个平行孔。检测基因转染后细胞对阿霉素敏感性的改变，IC50。

    细胞凋亡率的流式细胞术检测

    实验分组同上。转染24小时后,分别在K562 和K562/A02 细胞中加入和0.1 μg/ml和4 μg/ml的阿霉素，48小时后离心收集细胞，PBS洗涤后离心,弃上清;然后以70%冰乙醇在4℃条件下,固定24小时; RNA酶A（500  μg/ml)于37℃作用30分钟，最后在避光4℃条件下,以碘化丙锭(50 μg/ml)作用30分钟后,用流式细胞仪（Beckman coulter公司产品）检测凋亡细胞百分率。

    Caspase?3活性测定

    分组、处理同细胞凋亡率的流式细胞术检测。收集2×106个细胞,按半胱氨蛋白水解酶3活性测定试剂盒说明书裂解细胞、加入DEVD?AFC底物, 以荧光分光光度计400 nm激发波长、505 nm发射波长测定底物裂解产生的荧光强度。以荧光强度表示caspase?3相对活性。

    统计学处理

    全部数据以均数±标准差±SD 表示，进行t检验、F检验及q检验。

    结    果

    RPL6在K562和K562/A02细胞中的表达

    经RT?PCR检测及RPL6/β?actin灰度比值测定， K562 和K562/A02细胞的RPL6/β?actin灰度比值分别为1.08±0.11和1.45±0.15，K562/A02 mRNA的表达较K562高34%（P＜0.005）（图1）。

    RPL6在K562/A02细胞中的克隆

    通过T?A克隆法将cDNA片段重组入pGEM?T Easy，重组载体的酶切鉴定如图2。测序结果表明，所获DNA片段与GenBank中RPL6序列完全一致,碱基无突变。

    Figure 1.  Expression of RPL6 gene in K562  and K562/A02 cells. M: marker. Lane   1：K562. Lane   2:K562/A02

    Figure 2 Identification of recombinant plasmid  pGEM?TEasy/RPL6. M: marker. Lane 1: plasmid pGEM?TEasy/RPL6 digested by Ecor I. Lane   2: T?A vector.

    RPL6基因真核表达质粒的构建

    pcDNA3.1 (+) 的重组质粒经Kpn I酶切后,正向插入出现约5.8 kb和0.4 kb条带,反向插入则出现约5.6 kb和0.6 kb条带，结果如图3所示。

    Figure 3. Identification of recombinant plasmid pcDNA3.1（+）/RPL6. M: marker. Lane   1、2: forward insertion. Lane   3、4: backward insertion.

    转染RPL6 cDNA 真核表达质粒后K562和K562/A02 细胞对阿霉素敏感性的改变

    阿霉素对K562细胞、转染空载体的K562细胞、转染正义RPL6重组质粒的K562 细胞的IC50分别为(0.093±0.021)μg/ml 、(0.098±0.025)μg/ml 、(0.302±0.055)μg/ml,转染正义RPL6 cDNA 真核表达质粒后的K562细胞对阿霉素的耐药性是K562细胞的325%(P<0.001) , 空载体转染对K562细胞的耐药性无明显影响(P>0.05)。阿霉素对K562/A02细胞、转染空载体的K562/A02细胞、转染反义RPL6 cDNA真核表达质粒的K562/A02细胞的IC50分别为(4.816±0.931)μg/ml、(4.952±1.218)μg/ml 、(1.812±0.282)μg/ml,转染反义RPL6 cDNA 真核表达质粒之后的K562/A02细胞对阿霉素的耐药性是K562/A02细胞的38%(P<0.01), 空载体转染对K562/A02细胞的耐药性无明显影响(P>0.05) 。

    凋亡细胞百分率以及caspase?3活性

    经阿霉素作用于细胞24小时后,不同组的细胞凋亡率及caspase?3活性改变见附表。转染正义RPL6重组质粒的K562 细胞的凋亡和caspase?3活性降低，与K562细胞相比，差异有显著性(P<0.005)；转染反义RPL6 cDNA真核表达质粒的K562/A02细胞的凋亡和caspase?3活性上升，与K562/A02细胞相比，差异有显著性(P<0.005)（图4）。

     讨    论

    肿瘤细胞包括白血病细胞在产生耐药的过程中，除了已知的mdr1等基因表达改变外，尚有其他众多基因甚至未知的基因发生了改变［2，3］，涉及信号转导、DNA复制、转录调节和RNA加工以及细胞周期、凋亡等相关基因。在研究MDR中，发现、识别新的敏感细胞和耐药细胞之间的基因表达差异并分离、鉴定是阐明MDR机制的重要方法之一，快速、有效地获得差异表达基因的cDNA全长并逐一查明其在耐药中的作用对于阐明疾病发生机理乃至发育生物学的研究具有十分重要的意义。

    真核细胞约有80个核糖体蛋白，功能复杂，除参与蛋白质的合成外，核糖体蛋白还有核糖体外功能。Wool［4］了31种核糖体外功能，包括参与复制、转录、翻译调控、正常细胞恶性转化等。在调节药物敏感性方面，Lopez［5］发现高表达RPL35a的Jurkat淋巴细胞白血病细胞可抵抗柔红霉素诱导的凋亡，还可抵抗紫外线、抗Fas抗体及血清饥饿诱导的凋亡。通过转染L35a的cDNA亦证实细胞生存延长。该实验证实，某些核糖体蛋白可通过某种机制如调节细胞凋亡而影响肿瘤细胞的耐药或药敏。

    我们通过RT?PCR证实, RPL6基因在MDR白血病细胞株K562/A02中表达较白血病细胞株K562增高, 通过构建正反义RPL6 cDNA真核表达质粒并且转染相应细胞, 以MTT法证实RPL6可影响K562/A02细胞的耐药性，也就是说RPL6可能在白血病MDR的形成中起作用。 为进一步研究RPL6的作用机制，我们对转染细胞的凋亡和caspase?3活性进行了检测，结果发现细胞的凋亡和caspase?3亦有相应的增加和降低。一般认为，在凋亡发生过程中有两种caspase激活途径，一是受体调节的凋亡途径,TNF家族激活上游的caspase?8；二是线粒体调节的凋亡途径，线粒体释放细胞色素C，激活上游的caspase?9，这两条途径最终都激活下游的最重要的caspase?3［6，7］。Caspase?3是Caspase家族中重要的凋亡效应蛋白，活化的caspase?3能促进凋亡信号的传导, 诱导细胞凋亡的发生。由于caspase?3活性改变，推测RPL6基因可能通过作用于caspase依赖的凋亡途径，改变K562/A02细胞的凋亡水平而影响耐药。

【】
  1Wang X,Lan M,Shi YQ, et al. Differential display of vincristine?resistance?related gene in gastric cancer SGC7901 cell. World J Gastroenterol, 2002; 8:54-59

2Gottesman MM, Fojo T, Bates SE. Multidrug resistance in cancer: role of ATP?dependent transporters. Nat Rev Cancer, 2002; 2:48-58

3Wang D, Lippard SJ. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov, 2005; 4:307-320

4Wool IG. Extraribosomal functions of ribosomal proteins.Trends Biochem Sci,1996; 21:164-165

5Lopez CD, Martinovsky G, Naumovski L. Inhibition of cell death by ribosomal protein L35a. Cancer Lett, 2002; 180：195-202

6Kang JJ, Schaber MD, Srinivasula SM, et al. Cascades of mammalian caspase activation in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 1999; 274:3189-3198

7Stennicke HR, Jurgensmeier JM, Shin H, et al. Pro?caspase?3 is a major physiologic target of caspase?8. J Biol Chem, 1998; 273: 27084-27090