D-氨基半乳糖/内毒素诱导的急性肝衰竭与Th1/Th2失衡

                 作者：车德才 赵中夫 李水仙 武延隽 张芸

【关键词】  D-氨基半乳糖；内毒素；急性肝衰竭；Th1/Th2；IFN-γ/IL-4

　　摘要   目的：研究Th1/Th2失衡与D-氨基半乳糖/内毒素所致大鼠急性肝衰竭的关系。方法：30只Wistar大鼠腹腔内注射D-氨基半乳糖/内毒素诱导大鼠急性肝衰竭模型（AHF组），另取30只腹腔内注射等量生理盐水为正常对照（N组）。两组动物于建模后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h各取5只动物检测其血清丙氨酸转氨酶（ALT）与肝组织的病理形态学变化；ELISA检测不同时间点动物血清中Th1/Th2型细胞因子（IFN-γ/IL-4）水平的变化。结果：AHF组肝组织显示炎细胞浸润和明显坏死的急性肝衰竭特征，且各时间点血清ALT值均明显高于N组（P<0.05）；AHF组与N组相比血清内Th1型细胞因子（IFN-γ）的增高在3 h (P<0.01)、6 h（P<0.01）；Th2型细胞因子(IL-4)水平在各时间点无明显变化（P>0.05）。结论：在D-氨基半乳糖/内毒素所致大鼠急性肝衰竭模型中，存在Th1/Th2失衡，机体内发生了促炎反应，对此急性肝衰竭早期损伤起重要作用。

　　关键词   D-氨基半乳糖；内毒素；急性肝衰竭；Th1/Th2；IFN-γ/IL-4

　　Acute Hepatic Failure Induced by D-glactosamine/endotoxin and Th1/Th2 Imbalance     
　　Abstract   Objective：To research the relation of Th1/Th2 imbalance and acute hepatic failure induced by D-glactosamine/endotoxin.Methods：Wistar rats with acute hepatic failure (AHF group, n=30) were induced by intraperitoneal injection of D-glactosamine/endotoxin, normal controls (N group, n=30) were injected with saline solution.sera Alanine Transaminase(ALT) were determined and liver pathological morphology were observed at 3 h,6 h,12 h,24 h,48 h and 72 h following intraperitoneal injection,5 rats per time point; Simultaneously,sera Th1/Th2  cytokines (IFN-γ/IL-4) were examined by ELISA.Results:Infiltration of inflammatory cells and necrosis of hepatic cells were marked in AHF group,ALT increased significantly in AHF group than in N group (P<0.05) at all time points;Compared with N group, levels of sera Th1 cytokine (IFN-γ) were obviously higher at 3 h(P<0.01) and 6 h(P<0.01); Th2 cytokine (IL-4) weren′t obviously higher at all time points（P>0.05）. Conclusion：Th1/Th2 imbalance was found in the acute hepatic failure induced by D-glactosamine/endotoxin，so pro-inflammatory response play important role in the AHF models at early phase.

　　Key words   D-glactosamine;Endotoxin;Acute hepatic failure;Th1/Th2;IFN-γ/IL-4
           
　　乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）所致乙型病毒性肝炎是严重威胁人民健康和社会的传染性疾病。HBV不仅感染广泛，而且转归差异大，由其所致的急性肝衰竭更无特效疗法，死亡率高。然而HBV易感动物模型（黑猩猩）稀缺，又增加了对其深入研究的难度。本研究以D-氨基半乳糖/内毒素复制急性肝衰竭大鼠模型，探讨Th1/Th2失衡与急性肝衰竭发病的关系，以期为控制人类HBV感染提供实验依据。

　　1   材料与方法

　　1．1   实验动物分组   雌雄各半Wistar大鼠,60只，清洁级,180 g～220 g。由山西医科大学动物实验中心提供。将大鼠随机分为两组：急性肝衰竭实验组（AHF组，n=30只）：实验鼠在禁食12 h后，将700 mg/kg D-氨基半乳糖（重庆医科大学生物化学工程学院）和5 μg/kg内毒素（美国Sigma公司）用生理盐水溶液稀释至10 mL腹腔注射；正常对照组（N组，n=30只）：在相应建模时腹腔注射等量生理盐水。

　　1．2   检测样本留取  急性肝衰竭实验组和正常对照组动物分别于3 h 、6 h、12 h 、24 h、 48 h、 72 h时间点随机各取5只，行1%戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉采血，加入抑肽酶1 KIU/mL，离心将血清分装保存-20℃待检测，并留取肝组织，用10%甲醛固定做苏木素-伊红（HE）染色。

　　1．3   肝组织病理检查及血清丙氨酸转氨酶（ALT）检测  10%甲醛固定的肝组织，石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，光镜下观察组织形态学变化。血清标本采用赖氏法检测ALT含量。

　　1．4.   血清Th1/Th2型细胞因子检测  血清Th1/ Th2型细胞因子（IFN-γ/IL-4）的检测采用ELISA。试剂盒购自深圳市达科为生物技术有限公司（法国DIACLONE公司产品）。按试剂盒说明书操作。

　　1.5   统计学处理  采用SPSS 13.0软件包分析，计量资料以均数±标准差表示，多样本均数采用方差分析。

　　2   结果

　　2．1   实验动物血清丙氨酸转氨酶水平变化  实验组3 h ALT已开始升高，6 h 和24 h出现两个高峰：（858.57±45.59) U/L，(2 572.86±61.48) U/L，直到72 h ALT水平仍处于高水平（846.67±47.62) U/L。见表1。

　　表1   实验动物血清丙氨酸转氨酶水平变化 （略）

　　*与正常组相比P<0.05
 
　　2．2   肝组织病变化  正常对照组动物肝组织经HE染色，显示肝小叶结构完整；无肝细胞变性坏死。急性肝衰竭3 h后肝组织病理学检查变化不明显，6 h后有少量肝细胞变性，肝窦内少量充血，碎片状坏死，大量以中性粒细胞为主的炎细胞浸润；12 h后大量肝细胞小片状坏死，肝索断裂；24 h后肝细胞大片状坏死和肝窦内大量充血，肝细胞边界模糊；48 h后肝细胞坏死更加明显，弥漫以中性粒细胞为主的炎细胞浸润；72 h后肝组织发生大块状坏死，纤维网状支架塌陷，坏死组织中有嗜中性粒细胞等炎细胞浸润。

　　2．3.   实验动物血清Th1/Th2型细胞因子水平变化   血清中Th1型细胞因子IFN-γ在3 h、6 h达高峰，12 h恢复正常水平；Th2型细胞因子IL-4在各时间点均未见升高。见表2。
      
　　表2   实验动物血清IFN-γ/IL-4水平变化（略）

　　**与正常组相比 P<0.01  

　　3   讨论     

　　大量研究表明：D-氨基半乳糖/内毒素所致大鼠或小鼠的肝细胞损伤涉及包括抑制核酸及糖蛋白等生物大分子的合成、诱导肝细胞凋亡、自由基产生和脂质过氧化反应等在内的多种机制参与［１，2］。本实验所采用D-氨基半乳糖/内毒素的剂量与方法，成功建立了大鼠的急性肝衰竭模型。     

　　众所周知：机体受到包括感染和非感染性，如变性坏死的组织细胞及其产物、缺血、缺氧等的打击时，突出的表现之一是炎症反应。炎症反应是多种细胞和多种因子参与的复杂反应。其中，促炎介质与抗炎介质水平可以反映机体内炎症反应的状态。通常，机体内发生炎症反应时，炎细胞被激活释放促炎症介质，然而体内具有复杂的抗炎机制，炎细胞既能产生促炎介质，也能产生抗炎介质。抗炎介质与促炎介质在不同的环节上相互作用、相互拮抗，形成极其复杂的炎症调控。这种复杂精细调控的目的是将炎症控制在一定限度，防止过度炎症反应对组织的损伤。鉴于辅助性T淋巴细胞（helper T lymphocyte,Th）Th1亚群能分泌干扰素-γ（IFN-γ）等促炎介质，Th2亚群能分泌白细胞介素-4（IL-4）等抗炎介质，目前认为：Th1/Th2的状态在一定程度上能够反映体内促炎反应与抗炎反应的状态。本研究即选用最能代表Th1/Th2状态的IFN-γ/IL-4作为检测指标［３～5］，以期了解D-氨基半乳糖/内毒素所诱导的急性肝衰竭与Th1/Th2状态的关系。     

　　我们的检测结果表明：血清中Th1型细胞因子（IFN-γ）在急性肝衰竭模型建立后3 h、6 h达高峰，12 h恢复正常水平；Th2型细胞因子IL-4在各时间点均未升高。可见D-氨基半乳糖/内毒素所致急性肝衰竭的早期发病与Th1/Th2失衡有关，机体内发生了促炎反应。由此也说明，纠正Th1/Th2失衡有望成为控制临床急性肝衰竭包括HBV所致急性肝衰竭的有效措施之一。
 
　　

　　［１］   唐云安，刘玉清，王国钦.肝损伤动物模型研究进展.卫生毒理学杂志，2002，16（4）：236～238.

　　［２］   李绍旦，袁本利.实验性肝损伤与细胞凋亡.实验动物与管理，2002，19（2）：29～33.

　　［３］   王娟华，谢志萍，裴   浩.HBV慢性感染患者外周血Th1/Th2(Tc1/Tc2)细胞IFN-γ和IL-4的表达及其临床意义.第三军医大学学报，2004，26（18）：1　646～1　649.

　　［４］   Kardar G.A, Jeddi-Tehrani M, Shokri F.Diminished Th1 and Th2 cytokine production in healthy adult nonresponders to recombinant hepatitis B vaccine. Scand. J.Immunol.2002,55(3):311～314.

　　［５］   Jafarzadeh A, Shokri F. The antibody response to HBs antigen is regulated by coordinated Th1 and Th2 cytokine production in healthy neonates. Clin.Exp.Immunol.2003,131(3):451～456.