脐带源间充质干细胞促进造血细胞在NOD/SCID小鼠归巢
作者：张浪辉， 陈志哲， 吕璐璐， 王爱萍， 韩忠朝， 刘拥军
【关键词】 间充质干细胞；,,脐带；,造血干细胞；,受体,淋巴细胞归巢；,移植
摘要: 目的 探讨脐带源间充质干细胞（hUCMSC）在促进造血细胞归巢，提高造血干细胞植入中的作用。 方法 RTPCR检测经体外培养扩增所得hUCMSC归巢相关分子的表达；将hUCMSC和CFDASE荧光标记的人脐带血单个核细胞（MNC）植入NOD/SCID小鼠建立共移植模型，分离共移植24 h后小鼠骨髓有核细胞，用流式细胞仪和荧光倒置显微镜观察脐带血造血细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中含量的变化。 结果 hUCMSC表达SDF1及其受体CXCR4以及相关黏附分子CD11a/ICAM1、CD49d/VCAM1；在hUCMSC共移植情况下，流式细胞仪检测和荧光显微镜下细胞计数均发现人脐带血MNC在小鼠骨髓中的含量与单独脐带血移植相比较有显著提高〔（145±59)/1×105vs (298±72)/1×105；(755±158)/5×105vs (1598±227)/5×105个骨髓有核细胞；n=9,P<0.05）〕。 结论 hUCMSC具有表达化学趋化因子及相关黏附分子的特性，有利于实现自身的归巢定位并引导造血干祖细胞的有效归巢与植入;动物模型的建立进一步证实其引导脐带血MNC在NOD/SCID小鼠体内向造血龛――骨髓富集（归巢）的作用。
基础和临床研究揭示，造血干细胞移植的过程再现了胚胎发育时期和出生后造血干细胞从血液循环进入骨髓造血区域（造血干细胞的归巢）的全过程，这种移植初期的造血细胞正确归巢对于移植后的造血重建和有效恢复、提高移植的存活率是至关重要的环节[12]。但对于需要接受造血干细胞移植的患者，由于疾病和的影响，造血干细胞归巢所必须具备的相关环境遭到不同程度的破坏，直接导致造血前体细胞不能很有效的定位于骨髓造血区域，大大降低了造血干细胞的有效植入和维持长期造血的预期效果[3]。因此，尽可能提高造血干细胞的归巢率，继而提高临床造血干细胞移植的成功率是值得深入探讨的课题。作为造血微环境主要细胞成分――基质细胞的干/祖细胞，间充质干细胞（MSC）通过自我更新和多向分化构建起稳定的造血微环境，在造血干细胞的生长和增殖分化中发挥重要作用[4]。本课题组已通过二步酶解法从健康胎儿脐带中成功分离扩增到足够满足临床治疗需要的脐带源间充质干细胞（hUCMSC）[5]。笔者通过RTPCR检测hUCMSC归巢相关分子的表达并通过建立造血共移植的NOD/SCID小鼠动物模型，观察在hUCMSC共移植条件下脐带血造血细胞在NOD/SCID小鼠归巢情况的变化，旨在揭示hUCMSC在促进造血细胞归巢中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂TRIzolTM Reagent（美国Life Technoloies公司）；MMLV Rrverse Transcriptase Kit（美国Invitrogen公司）；Taq DNA聚合酶体系和DNA Marker(DL2000 MARK，日本Takala公司）；DMEMLG/DF12培养液（美国Sigma公司）；Ficoll淋巴细胞分离液（美国Pharmacia Biotech公司）；细胞示踪剂VybrantTM CFDA SE Cell Tracer Kit（美国Molecular Probes公司）；红细胞裂解液（FACS Lysing Solution，美国Becton Dickinson公司）。
1.2 RTPCR检测hUCMSC促进造血植入相关分子的表达
1．2．1 设计引物 检索Medline Gene Bank人基质细胞源因子1(SDF1)及其受体趋化因子CXC受体4（CXCR4）以及淋巴细胞功能相关抗原1α链(CD11a)/细胞间黏附分子1(ICAM1，CD54)、整合素α4（integrinalpha 4，CD49d）/血管细胞黏附分子1(VCAM1，CD106)等的基因序列，设计相应的引物序列：
SDF1（251 bp）
S:5’CCC TTC AGA TTG TAG CCC GG3’
A:5’CGA TCC CAG ATC AAT GTG CC3’
CXCR4（137 bp）
S:5'CAA CGT CAG TGA GGC AGA TG3'
A:5'ATG CAA TAG CAG GAC AGG ATG A3'
CD11a（305 bp）
S:5’CTG GCA GAA AGC AAA TGT GA3’
A:5’ACC AAG TGT GAC GTG AGC TG3’
CD49d（185 bp）
S:5’GTT CGG CTA CTC GGT CGT G3’
A:5’GGT TCT CTA TTA GGG CGT C3’
CD54（267 bp）
S:5’TAT GGC AAC GAC TCC TTC T3’
A:5’CAT TCA GCG TCA CCT TGG3’
CD106（434 bp）
S:5’TGT GCA CAG CAA CTT GTG AA3’
A:5’TTC TTG CAG CTT TGT GGA TG3’
βactin（217 bp）
S:5'CAG AGC AAG AGA GGC ATC C3'
A:5'CTG GGG TGT TGA AGG TCT C3'
1.2.2 hUCMSC培养和总RNA抽提 见[5]。
1.2.3 RTPCR与凝胶成像分析逆转录反应按照MMLV Rrverse Transcriptase Kit说明书进行。以逆转录产物cDNA为模板，加入Taq酶体系及相应引物序列，PCR扩增化学趋化因子SDF1及其受体CXCR4(CD184)以及相关黏附分子CD11a/ICAM1(CD54)、CD49d/VCAM1(CD106)，扩增条件为：95 ℃ 7 min→（94 ℃ 50 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min）×30循环→72 ℃ 10 min，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统（Gel Doc100，美国BioRad）进行成像分析。
1.3 人脐带血MNC的CFDASE示踪标记与hUCMSC的NOD/SCID小鼠共移植
1.3.1 NOD/SCID小鼠的准备实验小鼠选用7周龄的雄性小鼠（医学院北京实验动物所），饲养于层流无菌环境，无菌饮食，移植前3 d予环丙沙星100 mg/L，无菌饮水，移植前8 h予137Cs预处理照射，照射剂量为300 cGy。
1.3.2 人脐带血MNC的分离与CFDASE标记 人脐带血采自移植当日足月顺产胎儿（天津市妇产中心提供），按密度梯度法经Ficoll分离液分离收获MNC[每份脐带血细胞数约（1～3）×108]，PBS洗涤，离心沉淀后，加入37 ℃预热的终浓度为20 μmol/L的CFDASE PBS溶液3 mL，37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱孵育15 min；离心，吸弃标记液，加入新鲜低糖DMEMDF12完全培养液（含10%人AB血清）10 mL，移置T25培养瓶中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱孵育约30 min后，吸取少量标记细胞置倒置荧光显微镜下绿色荧光激发，见>95%细胞呈绿色荧光标记，提示标记完成。标记后细胞经PBS洗涤后定容为1×108 mL-1，重悬备用。
1.3.3 hUCMSC的培养和胰酶消化 对数生长期P3代hUCMSC经0.25%胰酶＋1 mmol/L EDTA消化，PBS重悬定容为5×106 mL-1，备用。细胞取材与培养同1.2.2。
1.3.4 NOD/SCID小鼠共移植分3组，经尾静脉注射移植细胞（表1）。
表1 NOD/SCID小鼠共移植分组（略）
1.4 移植后NOD/SCID小鼠骨髓中人脐带血MNC的示踪检测
1.4.1 流式细胞仪检测人脐带血MNC在NOD/SCID小鼠骨髓中的含量细胞移入24 h后常规断颈处死小鼠，游离小鼠下肢长骨，开放髓腔，用PBS反复洗脱收集骨髓细胞，经红细胞裂解液裂解红细胞后，制成骨髓有核细胞悬液，分置2份，取其中1份细胞悬液经PBS 1 mL洗涤后，PBS 400 μL重悬，移至流式上样管，上流式细胞仪（FACScan,美国BectonDickinson），在绿色荧光激发下检测经CFDASE标记的人脐带血MNC在小鼠骨髓有核细胞中的含量。
1．4．2 荧光倒置显微镜计数取上述另1份骨髓有核细胞悬液定量为5×105 mL-1，接种1 mL于24孔板中，静置30 min，使细胞沉淀于底部，置荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS)下，经由绿色荧光激发，计数各孔荧光标记阳性细胞。
1.5 统计学处理数据经SPSS 10.0统计软件处理，采用均数t检验。
2 结果
2.1 RTPCR检测hUCMSC促进造血植入相关分子表达hUCMSC表达化学趋化因子SDF1及其受体CXCR4以及黏附分子CD11a/ICAM1(CD54)、CD49d/VCAM1(CD106)（图1）。
1.CD106;2.SDF1;3.CXCR4; 4.CD11a; 5.CD49d;6.CD54;7.βactin;8.DL2000 MARK(bp):2 000,1 000,750,500,250,100
图1 RTPCR检测hUCMSC促进造血植入相关分子的表达（略）
2.2 流式细胞仪检测NOD/SCID小鼠骨髓中人脐带血MNC含量在hUCMSC共移植情况下，经CFDASE示踪标记的人脐带血MNC在NOD/SCID小鼠骨髓有核细胞中的含量与单独脐带血移植组相比较由[(145±59）/1×105]增加至[(298±72)/1×105)]个有核细胞（n=9,P<0.05）（图2）。
A：空白组，未检出人脐带血MNC（经CFDASE标记的阳性细胞）； B：共移植组，收集55 000个细胞，共检出161个阳性细胞，阳性率为0.30%； C：对照组，收集55 000个细胞，共检出83个阳性细胞，阳性率0.16%.
图2 流式细胞仪检测1例配对NOD/SCID小鼠骨髓中人脐带血MNC阳性率（略）
2.3 荧光倒置显微镜检测NOD/SCID小鼠骨髓中人脐带血MNC含量CFDASE示踪标记的人脐带血MNC在荧光倒置显微镜下发绿色荧光，镜下可见与单独脐带血移植组相比较，hUCMSC共移植组NOD/SCID小鼠骨髓有核细胞中人脐带血MNC含量明显增多（图3），细胞计数显示阳性细胞数由单独脐带血移植组的(755±158)/5×105提高到共移植组的(1 598±227)/5×105个有核细胞（n=9,P<0.05）。
A：实验组；B：对照组
图3 荧光倒置显微镜检测1例配对NOD/SCID小鼠骨髓中脐带血MNC分布（×100）（略）
3 讨论
影响造血干细胞移植成功的因素很多，而移植初期的造血细胞正确归巢定位对于移植后的造血重建有效恢复、提高移植存活率是至关重要的环节[6]。因此，如何提高造血细胞在受者骨髓造血微环境中的有效定位（归巢），成为急需解决的重大课题。MSC是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，具有自我更新、高度增殖和多分化潜能的特点，可被广泛用于多系统疾病的[78]。有研究表明，骨髓来源的MSC具有分泌化学趋化因子SDF1，表达其受体CXCR4及其他相关黏附分子的特性，通过表达这些归巢相关分子，骨髓MSC可引导造血干祖细胞准确归巢，从而促进造血干细胞的有效植入[910]。笔者通过RTPCR技术检测，发现hUCMSC同样表达SDF1和其受体CXCR4，以及CD11a、CD54、CD49d、CD106等黏附分子。推测hUCMSC通过自身CXCR4及相关黏附分子在实现自身有效归巢后（笔者通过NOD/SCID小鼠模型证实了hUCMSC的归巢效应），通过进一步分泌SDF1，表达相关黏附分子及细胞外基质成分修复因疾病和治疗的影响遭受损坏的造血微环境，引导造血细胞归巢于“造血细胞龛”中，实现造血细胞的有效植入[11]。
为了印证hUCMSC促进造血细胞有效归巢的效应，笔者建立了hUCMSC与脐带血MNC共移植NOD/SCID小鼠动物模型。通过细胞示踪技术，检测移植后24 h与单独脐带血移植比较，hUCMSC的共移植可以提高人脐带血MNC在NOD/SCID小鼠骨髓有核细胞中的含量，提示hUCMSC可能具有引导造血细胞在NOD/SCID小鼠体内向造血龛――骨髓富集（归巢）的作用。笔者选用MNC作为造血细胞的指标，是考虑到目前临床进行的造血干细胞移植绝大部分是采用包含多种细胞成分的单个核细胞来进行的。这些进入小鼠骨髓内的阳性细胞在多大程度上可代表具有支持长期造血重建的所谓造血干祖细胞，还有待对造血干/祖细胞标志的进一步认识，以及本课题研究的进一步深入。相信伴随着对hUCMSC促进干/祖细胞归巢机制认识的不断深入，hUCMSC共移植治疗在造血干细胞移植中的应用将进一步拓展，这对于提高临床造血干细胞移植成功率具有十分重要的意义。
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