泼尼松龙对脂多糖诱导的RANTES的影响
作者：朴花子，张成镐，方宇辉
【关键词】 泼尼松龙；小胶质细胞；RANTES；脂多糖
摘要：目的 探讨泼尼松龙对脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞激活时所分泌的趋化因子RANTES的影响。 方法 采用MEM培养液培养小胶质细胞，培养液中添加不同质量浓度的LPS(0、100、500、1000μg/L)及LPS(100μg/L)与10μmol/L的泼尼松龙后再培养12h，用ELISA法测定细胞外液所分泌的RANTES含量。结果 LPS能高度激活小胶质细胞并且能使RANTES分泌增加，泼尼松龙明显抑制RANTES的含量。 结论 泼尼松龙有抑制趋化因子RANTES的分泌作用。
关键词：泼尼松龙；小胶质细胞；RANTES；脂多糖
Effect of prednisolone on LPSinduced RANTES productionPiao Huazi, Zhang Chenggao, Fang Yuhui
KEY WORDS: prodnisolone; microglia; RANTES; lipopolysaccharide
小胶质细胞作为中枢神经系统的一种组织巨噬细胞，在中枢神经系统疾病中起重要作用[12]。研究显示，静息状态的小胶质细胞缺乏巨噬细胞样功能，但大脑受损伤时可激活小胶质细胞，一方面可通过与神经细胞直接接触， 发挥脑内吞噬细胞的毒性作用；另一方面是分泌的一些炎症介质如一氧化氮(nitric oxide, NO)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha, TNFα)、白细胞介素1(interleukin1, IL1)、趋化因子monocyte chemotactic protein1(MCP1) 和regulated upon activation normal T cell expressed and secreted (RANTES)等，导致继发性脑损伤。趋化因子是一类对白细胞游走和活化具有重要作用的蛋白超家族，除了具有对T细胞的募集功能外，还能参与调控多种生物过程， 如细胞黏附、吞噬、细胞因子产生、T细胞激活、血管生成与增殖等[34]。在各种原因所致的脑损伤过程中，趋化因子分泌增加，使炎症反应不断放大，会进一步加重脑损伤[5]。糖皮质激素类由于具有抗炎、稳定细胞膜的作用，多年来一直被作为重型颅脑损伤的重要辅助药物之一[6]。泼尼松龙属于中效肾上腺皮质激素类药，主要用于严重的细菌感染和严重的过敏性疾病、各种血小板减少性紫癜、粒细胞减少症、严重皮肤病、器官移植的免疫排斥反应、肿瘤的治疗及对糖皮质激素敏感的眼部炎症等。本文研究了泼尼松龙对小胶质细胞被脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激活时所分泌的趋化因子RANTES的影响。
1 材料与方法
1.1 实验试剂 泼尼松龙和LPS为美国 Sigma 公司产品，细胞培养液用的MEM(minimum essential medium)为美国Gibco BRL公司产品， RANTES ELISA 试剂盒为美国 R&D Systems 公司产品。
1.2 方法 取10只新生小鼠(1-2d龄)，在无菌条件下，剪开颅骨，取出脑组织[7]。分离后的细胞用100mL/L热灭活胎牛血清的MEM培养液培养10d后使用。细胞接种于48孔培养板(3.5×105细胞/mL，0.2mL/孔)中12h后进行实验。实验可分为空白对照组(正常细胞)、LPS处理组(在培养液中加入100μg/L的LPS)、泼尼松龙组(在培养液中加入10μmol/L的泼尼松龙)、试药组(LPS+泼尼松龙)，并继续培养12h后，用相应的 ELISA试剂盒来测定趋化因子RANTES含量。
1.3 统计学处理 实验各项数据用均数±标准差表示，采用t检验进行统计学处理分析。P<0.01被认为有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS对小胶质细胞分泌RANTES含量的影响 如图 1所示，LPS能高度激活小胶质细胞并且能使RANTES分泌增加。在MEM培养液中培养小胶质细胞，培养液中添加不同质量浓度的LPS(0、100、500、1000μg/L)，用ELISA法测定细胞外液所分泌的RANTES的含量。LPS处理后6h时细胞培养液中RANTES含量较空白对照组有明显增高，呈时间依赖性(图1)。
图1 LPS对小胶质细胞分泌RANTES含量的影响（略）
Fig.1 LPSinduced RANTES production in microglia
A: Cultured microglia were incubated with indicated concentrations of LPS for 12h; B: The culture medium was added with LPS (100μg/L) and the microglia were incubated for 3, 6, 12 and 24h. The supernatants were collected and assayed for RANTES protein accumulation by ELISA
2.2 泼尼松龙对LPS诱导的RANTES含量的影响 培养液中添加LPS (100μg/L)与 10 μmol/L的泼尼松龙后，再培养12h，测定细胞外液所分泌的RANTES 的含量。结果显示，泼尼松龙明显抑制RANTES分泌，与LPS组比较，差异具有统计学意义(P<0.01，图2)。
图2 泼尼松龙抑制LPS诱导的RANTES含量（略）
Fig.2 Prodnisolone inhibited LPSinduced RANTES production in microglia
After treatment of microglia with LPS 100μg/L for 12h in the absence or presence of prodnisolone 10μmol/L, RANTES was evaluated using ELISA kit. **P<0.01 (Sheffes test)
3 讨论
小胶质细胞参与CNS的各种生理和病理过程。 脑缺血后，反应性小胶质细胞一方面转化为吞噬细胞，通过吞噬死亡神经细胞残骸和变性的突触， 有利于神经元再生和死亡周边区神经元的存活。另一方面通过释放和分泌一系列的神经毒性物质和炎性因子，如氧自由基、NO、超氧化物、TNFα、IL1β和蛋白酶等，导致继发性脑损伤。中枢神经系统的炎症反应与神经退行性疾病的发生密切相关, 如Alzheimer症、多发性硬化、AIDS性痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化及创伤后脑缺血损伤。在这些疾病发生过程中,大脑定居的免疫细胞小胶质细胞发挥重要作用。大量研究结果证明, 活化的小胶质细胞产生大量的NO、TNFα、ILβ、自由基及类花生酸类物质等致炎物质和潜在的细胞毒性因子，引发的中枢神经系统炎症反应是神经变性疾病早期主要事件,过量生成/积聚的炎症因子与神经细胞死亡有关。因此，抑制小胶质细胞活性被认为是研究神经保护策略中的主要焦点之一。LPS 能高度活化小胶质细胞并产生NO、TNFα、ILβ、自由基及趋化因子等致炎物质,从而引起神经元的损伤[8]。人们常把能否逆转LPS引起的小胶质细胞活化作为评价神经保护作用的客观指标。趋化因子在各种中枢性损伤初期阶段，可能促进损伤的修复和痊愈。 然而，它们的慢性病变增加和过多分泌会加重炎症和损伤。RANTES属于CC趋化因子家族中的一员，在脑损伤过程中起非常重要的作用。泼尼松龙属于中效糖皮质激素类药，主要用于严重的细菌感染和严重的过敏性疾病、各种血小板减少性紫癜、肿瘤的及对糖皮质激素敏感的眼部炎症等。糖皮质激素类由于具有抗炎、稳定细胞膜的作用，多年来一直被作为重型颅脑损伤的重要辅助治疗药物之一[6]。白宇等[9]曾有报道，甲基泼尼松龙对急性脑衰竭有显著治疗作用, 对于全身性疾病所致的急性脑衰竭疗效显著优于颅内疾病所致者。为进一步研究泼尼松龙的神经保护作用机制，本实验观察泼尼松龙对小胶质细胞激活时所分泌的趋化因子RANTES的影响。结果表明泼尼松龙对正常的小胶质细胞无明显影响，却对LPS诱导的小胶质细胞激活时所分泌的RANTES的含量有明显的抑制作用。这些结果提示，泼尼松龙的神经保护作用可能通过抑制小胶质细胞活化时所分泌的趋化因子而产生。这为进一步阐明泼尼松龙的神经保护作用机制提供了有力的实验依据。
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