通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

             作者：郑国玺，韦俊荣，祝康，侯瑾，施典羽，朱宏亮，杨广笑，王全颖

【关键词】  重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因；NIH3T3

　　摘要：目的  构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法  使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后，插入了重组腺病毒专用穿梭质粒pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒，构建了重组AAV通用载体质粒pSSHGCMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后，使用pSSHGCMVGFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞，制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度，并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞，荧光显微镜观察GFP表达。结果  重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL，浓缩后可达2×1013cfu/mL，表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后，在包装病毒和辅助质粒的联合作用下，能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFPAAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论  构建的重组AAV通用载体pSSHGCMV可转染外源基因，这为进一步的基因治疗奠定了基础。

　　关键词：重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因治疗；NIH3T3

　　Construction of a gengeral adenoassociated virus vector and GFP expression in rat NIH3T3 transduced by the rAAV vector

　　ABSTRACT: Objective  To construct a universal adenoassociated virus (AAV) vector and to detect the ability of the rAAV vector to transfer gene into the target cell. Methods  By using recombinant technique, the gene elements of AAV Rep and Cap genes between ITRs of pSSV9int- plasmid were replaced by expressing cassette in pACCMVpLpA plasmid, a recombinant adenovirus shuttle vector. The expressing cassette included a CMV promoter, a multicloning sites (MCS) and a polyA signal. The new plasmid constructed was named pSSVHGCMV, which was a universal adenoassociated virus (AAV) vector. After GFP report gene was inserted into MCS of the plasmid, the rAAV vector expressing GFP, pSSVHGCMVGFP plasmid, have been constructed and then it introduced into 293 cell by method of Ca3(PO4)2 using three plasmids of pSSVHGCMVGFP, pGF140 and pAAV/Ad. After the cell was transfected for 72h, the rAAV was harvestd and the titrations of rAAV stocks and rAAV concentrated were detected by dotblot test using digGFP probe. The GFP expression in rat NIH3T3 was observed by fluorescence microscop after the cell was infected for 24, 48 and 72h. Results  Titration of rAAV stock produced using new rAAV vector and procedure ranged between 1×1011 and 2×1012 total practicles/mL, and it was increased 100 times in rAAV concentrated than it did in rAAV stock. The NIH3T3 infected rGFPAAV expressed significantly GFP fluorescence, which showed that rGFPAAV was infectious virions. Conclusion  The rAAV vector constructed in this paper, pSSHGCMV plasmid, can transfer exterior gene into the target cell using proceeding of recombinant AAV and it may be used in research of gene therapy.

　　KEY WORDS: recombinate adenoassociated virus; vector; report gene; gene therapy; NIH3T3

　　感音神经性耳聋是当今危害人类健康的重大疾病。根据残疾人联合会抽样调查统计数据，中国现有各类残疾人总数约6000万，其中语言残疾者就有2057万，占34.3%；而世界卫生组织的一项区域性统计显示，在全世界范围内有轻度听力损失近6 亿人，中度以上的听力损失2.5亿人，严重影响着人类的健康和生活质量[1]。随着对内耳疾病分子生物学的深入研究和基因治疗技术的不断，为感音神经性耳聋的临床治疗带来了希望。但基因治疗临床应用的最大障碍之一便是转基因技术中载体系统的选择。在本实验中，我们成功构建的重组腺伴随病毒(recombinate adenoassociated virus, AAV)通用载体pSSHGCMV，可转导外源基因，为进一步用于感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株、质粒、酶及试剂  E.coli DH5α、pACCMVpLpA、pFG140辅助病毒质粒和细胞株(293细胞)由西安华广生物工程有限公司提供；骨架质粒pSSV9int-和pAAV/Ad由美国匹斯堡大学生物研究室构建，第四军医大学基础部病理研究室张桐博士惠赠；pGFPN2质粒购于Cloning Tech公司；牛血清白蛋白、Klenow 酶、T4DNA 连接酶、dNTP和限制性内切酶购于华美公司；RPMI1640 培养基购于Gibco BRL 公司；胰蛋白胨、酵母提取物购于英国Unipath 公司；核酸杂交试剂盒和地高辛标记及检测试剂盒购于德国Boehringer Mannhein 公司；琼脂糖购于中国院生物物理研究所生化厂；其他试剂及全部实验设备均由西安华广生物公司提供。

　　1.2  pSSHGCMV及pSSHGCMVGFP载体的构建策略  见图1。

　　1.3  AAVGFP重组病毒的包装和病毒浓度滴定  重溶3种质粒(pSSHGCMVGFP、pAAVAd及pFG140)，酒精沉淀一次，加去离子水，定量DNA为1g/L。配制DNA磷酸钙共沉淀物12瓶。

　　2×HBS     60mLpSSHGCMVGFP      60μLpAAVAd     60μLpFG140     120μL双蒸去离子水     5.16mL2.5mol/L CaCl2     600μL (5%)   

　　配制方法：按顺序先加入2×HBS(mol/L：15 Na2HPO4、10 KCl、280 NaCl、12葡萄糖、50 HEPES, pH7.0)。液体配制完毕放置30min，然后加至80%融合的293细胞的培养瓶中，转染5h后，倒掉磷酸钙培养液，并用3-5mL培养液洗3遍。加入10mL含10%(体积分数)小牛血清的细胞培养液，置37℃、5%(体积分数)CO2孵箱培养72h后，收获细胞，回收重组病毒颗粒。斑点杂交法测定重组病毒滴度。

　　图1  pSSHGCMV及pSSHGCMVGFP载体的构建（略）

　　Fig.1 The strategy for construction of the recombinant pSSHGCMV and pSSHGCMVGFP

　　1.4  大鼠NIH3T3细胞培养和重组rAAVCMVGFP感染NIH3T3  复苏NIH3T3 细胞，接种培养，3d传代1次至第5代，将密度为106个/mL的细胞悬液分别加入预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，放入5%(体积分数)CO2、37℃培养箱中培养。待细胞成片后，以10倍感染复数(MOI)的病毒剂量感染细胞，感染后24、48、72h置荧光显微镜下观察，随机计数5个视野的总细胞数和具有GFP荧光的细胞数。

　　2  结果

　　2.1  pSSHGCMV及pSSHGCMVGFP载体的构建  图2显示了构建的pSSHGCMV载体质粒酶切鉴定结果。表明从pACCMVpLpA质粒回收1206bp的具有CMV启动子、多克隆位点和SV40polyA的表达盒已经插入到骨架质粒的两个ITR之间。图3表明该载体的多克隆位点中的EcoRⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SalⅠ和HindⅢ 酶切点在该载体中均是唯一的，同时证实了表达盒的插入方向。

　　图2  pSSHGCMV载体酶切分析电泳图（略）

　　Fig.2 Identification of the recombinant vector pSSHGCMV

　　A: plasmid; B: EcoRⅠ/pSSHGCMV; C: PVUⅡ/pSSHGCMV; D:100bp ladder marker; E: λDNA/HindⅢ marker

　　图3  pSSHGCMV多克隆位点鉴定（略）

　　Fig.3 Identification of the MS in pSSHGCMV

　　A: EcoRⅠ; B: KpnⅠ; C: BamHⅠ; D: XbaⅠ; E: SalⅠ; F: HindⅢ; G: EcoRⅠ+ClaⅠ; H: HindⅢ+ClaⅠ; I: plasmid; J: 100bp ladder marker; K: λDNA/HindⅢ marker   

　　应用PCR方法成功地在pGFPN2质粒中扩增获得了两端含有内切酶切位点的GFP DNA片段(图4)，表明GFP DNA片段已经成功插入到pSSHGCMV质粒中，组建了可以表达GFP的AAV载体pSSHGCMVGFP(图5)。

　　2.2  AAVGFP重组病毒的包装和病毒浓度滴定  经斑点杂交证实浓缩后的AAV滴定为2.25×1013cfu/mL。结果表明三质粒磷酸钙共沉淀转染293包装细胞，可以有效包装重组AAV。

　　2.3  感染了重组病毒的NIH3T3中报告基因GFP的表达  大鼠NIH3T3细胞感染AAVGFP重组病毒24h后，可见到GFP的表达，这时表达的荧光弱，阳性细胞仅占20%左右；48h后表达增强，75%左右的细胞均有明显的荧光(图6)；72h后，荧光阳性细胞可达90%。使用10倍MOI的重组病毒剂量，在体外培养条件可以使90%细胞感染和表达外源基因。

　　图4  PCR扩增产物GFP（略）

　　Fig.4 The amplification results of GFP

　　A: PCR 200bp ladder marker; B: PCR products

　　图5  pSSHGCMVGFP酶切分析电泳图（略）

　　Fig.5 Identification of pSSHGCMVGFP

　　A: λDNA/HindⅢ; B: 200bp ladder marker; C: EcoRⅠ+BamHⅠ; D: EcoRⅠ; E: plasmid

　　图6  rAAVGFP重组病毒感染大鼠NIH3T3细胞48h后的荧光阳性细胞（略）

　　Fig.6 The NIH3T3 infected rAAVGFP expressed significantly GFP fluorescence (×200)

　　3  讨论

　　感音神经性耳聋是当今危害人类健康的重大疾病，严重影响着人类的健康和生活质量。内耳疾病的基因已逐渐成为研究的热点，它通过载体把正常基因或有治疗作用的基因导入靶细胞，纠正先天基因缺陷或者合成具有治疗作用的蛋白, 从而达到治疗疾病的目的。理想的体内基因转移载体应有较好的细胞靶向性、目的基因表达的可控性以及转移方法的简易性。自20世纪70年代末病毒载体的概念提出以来，用于基因治疗研究的缺陷性病毒载体的种类日渐增加，应用也愈加广泛。其中AAV载体是目前病毒类转基因系统中较新的成员。由于该系统最大的优点之一是其安全性较好，并且最有可能成为将外源基因整合入宿主细胞染色体的病毒载体系统，因此倍受关注，并已开始应用于临床试验。其特点如下：①AAV是一种缺陷病毒，在没有辅助病毒存在的情况下，该病毒不能复制和产生溶细胞性感染，因而不会独立引起人类疾病，是一种安全的病毒[2]；②AVV能稳定而有效地将病毒基因组整合到宿主细胞特定染色体的特定位点(人第19号染色体长臂19q13.4ter AAVS1位点)上[3]，没有插入激活原癌基因的危险，而有稳定的染色体环境，有利于所携带外源基因的表达；③AAV可以感染分裂或静止状态的细胞[4]，病毒宿主范围广，容易生长，物理性能稳定，可能获得高滴度的病毒，因而有较好的基因治疗应用前景。近年来2型人腺伴随病毒(AAV2)作为转基因载体的研究受到了人们越来越多的重视。AAV2具有良好的神经亲和性， 可以特异地转染神经元，且AAV 衣壳蛋白可以和靶细胞表面的受体结合, 从而相对容易进入靶细胞[5]。Duan等[6] 将AAV注入豚鼠耳蜗，在螺旋神经节和血管纹见到其表达。Stone 等[7]应用AAV2有效地转导入豚鼠体外培养耳蜗毛细胞，并在内、外毛细胞成功表达，同时发现AAV1、AAV2 能够转染内、外毛细胞，而AAV5 不能。关于外源基因启动子，本实验选择CMV启动子，就是因为其是强启动子，有利于基因在特定组织中有效和长时间地表达[8]。本实验以野生型AAV2载体pSSV9int为基础，使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后，插入了重组腺伴随病毒专用穿梭质粒pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒，成功地构建了重组AAV通用载体质粒pSSHGCMV；并且在该质粒MCS插入GFP基因后，使用pSSHGCMVGFP、pGF140和pAAV/Ad 3种质粒共转染293包装细胞，制备了GFP重组AAV，在包装病毒和辅助质粒的联合作用下，产生了具有感染性的重组AAV。这不仅为转导外源基因创造了条件，也为进一步用于感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。

　　：

　　[1]杨伟炎. 国内聋病基因研究取得新进展 [J]. 中华耳杂志, 2005, 3(4):239240.

　　[2]赵世巧，冯文莉. 基因治疗的病毒载体研究进展 [J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 2005, 26(10):709711.

　　[3]Kotin RM, Simiscalo M, Samulski RJ, et al. Site specific integration by adenoassociated virus [J]. Proc Natl Acad Aci USA, 1990, 87(6):22112218.

　　[4]Kotin RM. Prospects for the use of adenoassociated virus as a vector for human Gene Therapy [J]. Hum Gene Therapy, 1994, 5(6):973981.

　　[5]Bartlett JS, Samulski RJ, McCown TJ. Selective and rapid uptake of adenoassociatedvirus type 2 in brain [J]. Hum Gene Ther, 1998, 9(8):11811186.

　　[6]Duan ML, Bordet T, Mezzina M, et al. Adenoviral and adenoassociated viral vector mediated gene transfer in the guinea pig cochlea [J]. Neuroreport, 2002, 13(10):12951299.

　　[7]Stone IM, Lurie DI, Kelley MW, et al. Adenoassociated virusmediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea [J]. Molecular Herapy, 2005, 11(6):843848.

　　[8]Lalwani AK, Walsh BJ, Carvalho GJ, et al. Expression of adenoassociated virus integrated transgene within the mammalian vestibular organs [J]. Am J Otology, 1998,19:390395.