基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因C1反式调节基因
作者：蔺淑梅，成军，杨媛，刘敏，张黎颖，郭江
【摘要】 目的 对未知功能基因C1转染人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)后的基因表达谱进行分析，探索该基因的表达对肝细胞基因表达谱的影响及其可能的调节功能线索。方法 以分子生物学技术构建C1的真核表达载体pcDNA3.1(-)?C1，以表达质粒pcDNA3.1(-)?C1转染HepG2细胞，空载体pcDNA3.1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA，逆转录为cDNA。 应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果 HepG2细胞经转染C1表达质粒后，有26条差异表达基因，其中24条基因表达水平下调，2条基因表达水平上调。这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、细胞增生分化及肿瘤的发生密切相关。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了C1转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明C1蛋白可能的生物学功能及乙型肝炎病毒核心蛋白的致病机制提供了理论依据。
【关键词】 乙型肝炎病毒；核心蛋白；反式激活基因；基因表达谱芯片
乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)是组成核壳的主要成分，由183个氨基酸残基(aa)组成，分子质量为21-22ku。在HBV的生活周期中，HBcAg、mRNA和DNA聚合酶共同构成核心颗粒，在核心颗粒中完成病毒DNA的合成。HBcAg不仅具有保护病毒mRNA，防止其被RNA酶降解的作用，而且对于HBV前基因组RNA的装配、基因组DNA的合成亦有重要作用，还与病毒成熟、识别包膜蛋白以及病毒向细胞外释放等过程密切相关[1?2]。在介导免疫应答方面，HBcAg特异性CD4+ T细胞免疫应答是清除HBV的重要反应[3]；另外，B细胞刺突尖部有HBcAg的抗原决定簇，可产生相应的体液免疫反应[4]。我们利用酵母双杂交系统3，以HBcAg作为“诱饵”，对白细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用的蛋白进行研究，获得了一种能与HBV核心蛋白结合的新蛋白，将编码该蛋白的基因命名为C1。我们首先应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)筛选C1表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因，并进行分析，为今后更加广泛深入地研究新基因C1功能及核心蛋白的反式调节作用打下了基础，并为乙型肝炎发病机制提供新的研究方向。
1 材料与方法
1.1 材料
人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞由本室保存；细胞培养相关试剂、总RNA提取试剂Trizol及pcDNA3.1(-)真核表达载体均购自Invitrogen公司；FuGENE6 转染试剂购自Roche公司；pcDNA3.1(-)? C1由本室构建；表达谱芯片由上海联合基因有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及取材
在35mm培养皿中常规培养HepG2细胞，细胞生长至对数期时，分别以脂质体转染试剂FuGENE6将2μg pcDNA3.1(-)?C1和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞，48h后收获细胞，每5×106个细胞加入1mLTrizol试剂，立即于液氮中保存。
1.2.2 总RNA提取
使用Trizol试剂一步法提取pcDNA3.1(-)?C1和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组)。样品经分光光度计检测吸光度A值，并行热稳定实验，于-20℃和70℃保温1h后，经琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S条带变化。
1.2.3 探针标记
常规方法逆转录标记cDNA探针并纯化。Cy3?dUTP标记对照组细胞mRNA(5μg)，Cy5?dUTP标记实验组细胞mRNA(5μg)，乙醇沉淀后溶解在20μL 5×SSC+2g/L SDS杂交液中。
1.2.4 芯片制备
芯片包含的1152个cDNA由上海联合基因有限公司提供，包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等。以通用引物进行PCR扩增，PCR产物长度为1000-3000bp。靶基因以0.5mg/L溶解于3×SSC溶液中，用Cartesian公司的Cartesian 7500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样。玻片经水合(2h)、室温干燥(0.5h)、紫外线交联，再分别用2g/L SDS、水及2g/L的硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。
1.2.5 预杂交
将预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的芯片放入95℃水浴锅内变性30s，芯片取出后即放入无水乙醇中30s，晾干。将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5-6h。
1.2.6 杂交及洗涤
将探针置于95℃水浴中变性2min，芯片置于95℃水浴中变性30s；芯片取出浸无水乙醇30s，探针取出后迅速置于冰上。将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜(16-18h)。依次以2×SSC+2g/L SDS、1g/L×SSC+2g/L SDS、1g/L×SSC洗涤10min，室温晾干。
1.2.7 扫描与分析
用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片，用预先选定的内参照基因(24条管家基因，每个基因2个点，共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正，用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度，Cy5/Cy3比值。阳性结果判断：Cy5/Cy3>2.0，红色荧光，显示表达增强；Cy5/Cy3<0.5，绿色荧光，显示表达减弱。
2 结 果
2.1 总RNA的定性、定量分析
实验组和对照组总RNA的吸光度A260/A280值分别为2.03和2.02。热稳定实验70℃保温1h与-20℃ 1h的电泳条带比较，显示28S条带无明显降解，电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA。
2.2 芯片杂交体系验证及结果分析
在芯片上共有1152个cDNA。为了监控芯片杂交体系，在芯片上设置了阴性对照(8条水稻基因，共8个点)，这些点的杂交信号均很低，证实了数据的可靠性。 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色)，对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色)，红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异，黄色代表表达水平无差异。在基因芯片的扫描分析中，发现有2种基因的表达水平上调，即膜转运蛋白[membrane transport protein (XK gene)]和胰岛素诱导基因?1 (INSIG?1)，它们的Cy5/Cy3分别为2.170和2.870；有24种基因的表达水平下调，见表1。表1 表达显著降低的基因（略）
3 讨 论
基因表达谱芯片技术是近年来新起来的一项研究差异基因表达的分子生物学前沿技术，通过将大量的基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块固相载体上，与待测样品杂交后用激光共聚焦荧光检测系统进行结果扫描、检测，对来源不同的个体、组织、发育阶段、分化阶段、病变及刺激条件下的细胞内的mRNA或cDNA进行分析，获得大量有价值的生命信息[5?6]。本研究应用基因表达谱芯片技术，对白细胞cDNA文库中未知功能的HBcAg结合蛋白新基因C1表达质粒pcDNA3.1(-)?C1和空载体对照分别转染的HepG2细胞差异表达的mRNA进行检测，通过分析二者之间基因表达的差异信息，寻找C1反式调节基因。在1152个基因中筛选出26个差异表达的基因，其中24个是表达降低的基因，包括小窝蛋白1(Caveolin?1)、基质金属蛋白酶14(MMP14)、趋化因子(C?X?C基序)配体9(CXCL9)、G蛋白通路抑制因子2 (GPS2)转录变异体1、磷脂酶Cβ1转录变异体2等。以下基因的表达降低尤其值得我们关注。Caveolin?1是小窝的主要结构和调节成分，小窝则是细胞质膜上呈多种形态的凹陷结构,主要由蛋白质和脂类组成，不仅参与跨膜物质转运,而且是细胞信号分子富集和信号转导的枢纽，对其中多种关键性信号分子的活性状态起直接调控作用,从而参与细胞的分化、增殖、肿瘤发生及炎症等多种病理生理过程[7]。Caveolin?1在组织中广泛分布，主要参与信号转导和物质的跨膜转运及胞内运输，调控癌细胞的转化、肿瘤发生及转移[8]。绝大多数研究支持Caveolin?1是一种肿瘤抑制基因,其正常表达使细胞维持良性生长、分化的表型。Caveolin?1表达的下降可以驱使细胞转化, 甚至导致细胞生长的失控。研究发现在肿瘤细胞中Caveolin?1水平下调、甚至缺失[9]。在肿瘤恶性转化、恶性增殖的过程中,Caveolin?1 水平下调，又使细胞获得非贴壁依赖性生长的性质,促进肿瘤的发生及肿瘤细胞浸润、转移[10]。 这些研究提示Caveolin?1的异常表达可能参与了某些疾病的发生机制，表达下降与肿瘤的发生发展相关[11]。CXCL9是一种信号细胞因子，作为T细胞和NK细胞的化学引诱物，促进免疫和炎症反应，参与细胞的生长、移动和激活。 动物模型研究显示CXCL9是INF?γ和IL?12抗肿瘤活性的重要组成部分。CXCL9基因在INF?γ诱导下的表达，需要激活的NF?kappaB的参与，在人肿瘤细胞系Ca9?22和A172中NF?kappaB活性水平降低，因此在肿瘤组织中未检测到CXCL9的mRNA[12]，故认为CXCL9表达的降低则可能有利于肿瘤的发生发展。TRAF和TNF受体相关蛋白(TTRAP)是一种新的蛋白质，与胞浆区CD40和TNF受体相关因子(TRAFs)相互作用，可抑制NF?kappaB的激活，NF?kappaB已知在免疫和炎症反应中扮演极为重要的角色。进一步的研究发现TTRAP是Mg2+/Mn2+?依赖的磷酸二酯酶超家族的一员，TTRAP与人APE1(一种Mg2+?依赖的核酸内切酶)相关，在TNF受体家族介导的信号和功能中发挥着与APE1类似的DNA修复核酸内切酶的作用[13]。因此推测TRAF和TTRAP与细胞信号转导、机体抗炎及抗肿瘤免疫相关。GPS2是G蛋白和细胞分裂素活化蛋白激酶调节通路抑制因子，有报道指出人乳头瘤病毒E2蛋白结合GPS2，它们之间的相互作用对于E2的转录激活是必要的，同时也显示可影响细胞转录因子的活性。有研究发现，在体内和体外GPS2与p53具有相关性，并且通过增强p53依赖的转录来促进p53的应答。在U2OS细胞中GPS2的过度表达增加了p21(WAF1/CIP1)的基础表达水平，并引起G(1)的障碍，U2OS细胞GPS2稳定过度表达增加细胞的凋亡，这些数据证实GPS2可调节p53的活性[14]；p53则是具有广泛抑癌作用的重要基因，GPS2的表达降低可能影响p53的表达，从而有利于肿瘤的发生发展。磷脂酶Cβ1(PLCB1)通过激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C酶调节第二信使分子甘油二酯(DAG)和1,4,5?三磷酸肌醇(IP3)的产生，该过程以钙作为辅助因子，并在细胞内转导和细胞外信号中发挥重要的作用。该基因被两种G?蛋白α亚单位(α?q,α?11)激活，存在两种转录变异体编码不同的亚型，在细胞生长中发挥重要的作用,通过比较在正常细胞内和肿瘤细胞内的作用，证实了PLCB1在控制细胞的循环中作为一种重要的信号调节因子而发挥着作用[15]。细胞分裂素活化蛋白激酶激酶激酶激酶4(MAP4K4)属于GCK?IV亚家族，通过TAK1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶特异的激活JNK信号通路，参与TNF?α(肿瘤坏死因子?α)启动子的激活[16]。 而TNF?α是一种重要的细胞因子,它在HBV感染病毒清除中具有重要作用，MAPK4的表达降低有可能影响TNF?α的活性，可能与HBV感染慢性化有关。受C1表达影响上调的基因中，包括膜转运蛋白[membrane transport protein (XK gene)]和胰岛素诱导基因1(INSIG1)。 其中胰岛素诱导基因1在参与代谢控制的组织生长和分化中发挥作用，在细胞生长的G0/G1转变过程中发挥调节作用[17]。我们利用基因表达谱芯片技术对C1蛋白差异调节基因的表达进行研究，结果表明细胞内C1蛋白的表达可对以上基因进行调控，引起的生物过程涉及许多不同基因表达的变化，这些基因与细胞信号转导、机体抗病毒免疫及肿瘤发生等生物过程密切相关。C1则是一种能与HBcAg结合的蛋白基因，推测C1在HBcAg的致病过程中发挥重要桥梁作用。本结果为深入了解C1基因的生物学功能、对细胞内复杂的信号通路的调节及其在HBV致病机制中的作用提供重要的线索。
【】
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