结肠癌患者外周血DcR3与CEA联合测定的临床价值
作者：胜利，安利峰，史霖，王军阳，范桂香，袁育康
【摘要】 目的 联合检测结肠癌患者外周血中DcR3与癌胚抗原(CEA)mRNA的水平，建立取材于外周血的早期诊断结肠癌的新方法。方法 44例结肠癌患者和30名健康志愿者，各取5mL静脉血，肝素抗凝，密度梯度离心法分离外周血单核细胞，细胞总RNA TRIzol提取液提取外周血单核细胞总RNA，用半定量RT PCR法检测外周血单核细胞中DcR3与CEA mRNA的水平，并用t检验进行比较。结果 结肠癌患者外周血中DcR3基因的相对表达水平为0.415±0.078，与健康对照组(0.235±0.074)比较有显著性差异(P<0.05)，但患者之间没有明显差异(P>0.05)。CEA在结肠癌患者外周血中阳性率为36.4%(16/44)，表达水平为0.346±0.071。30名健康志愿者均为阴性。结论 DcR3基因在结肠癌患者外周血中表达水平明显高于健康人, 其表达水平与结肠癌有相关性。在CEA阴性情况下，DcR3可能成为新的肿瘤标志物。
【关键词】 DcR3；癌胚抗原；结肠癌
结肠癌为我国发病率较高的恶性肿瘤之一，手术为最有效的手段。然而术后生存率并不理想。根治性手术后的患者中仍有20%-45%可出现远处转移。早期定量检测出外周血中的循环肿瘤细胞并及早有效的综合治疗，具有重要的临床意义[1]。有的研究者认为结肠癌的发生是一个涉及多种癌基因及抑癌基因多个阶段的过程，是多种癌基因协同作用的结果[2]。DcR3(decoy receptor 3)是新近发现的肿瘤坏死因子受体家族的成员,表达一种缺乏跨膜序列的可溶性分泌蛋白，可竞争Fas与FasL的结合，从而阻断由Fas介导的细胞凋亡，在多种肿瘤及自身免疫性疾病中高表达，被认为和肿瘤的发生、以及免疫逃逸密切相关[3]。而癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是目前应用最广泛的肿瘤标志物之一，在结肠癌及其他恶性肿瘤有不同程度的阳性率，尤在结、直肠癌患者中升高最显著[4]。但是，CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值[5?6]。目前，CEA检测在临床上已经成为常规检查，主要用于结肠癌患者的预后判断、疗效观察以及复发和转移的监测。为了明确DcR3基因在结肠癌患者体内过度表达的意义，我们采用RT PCR检测了结肠癌患者外周血中该基因的mRNA表达水平，探讨其与结肠癌的相关性，以建立取材于外周血早期诊断结肠癌的新方法。
1 材料与方法
1.1 标本来源
2004年5月至2005年12月在西安大学医学院第一附属就诊，经病确诊的初发结肠癌患者44例，男25例，女19例，年龄27-78岁，平均52岁。健康对照组30例，男18例，女12例，年龄28-65岁，平均46岁。
1.2 主要设备和仪器
7700型荧光定量PCR仪系美国PE公司产品；TGL?16M型高速冷冻离心机系长沙科威实业有限公司产品；LD5?2A型低速离心机系北京医用离心机厂产品；DR?HW?2电热恒温水温箱系北京西城区医疗器械厂产品；SANYO型低温冰箱系日本日立公司产品；凝胶电泳成像分析系统TannonGIS1000系上海Tannon有限公司产品。
1.3 主要试剂
细胞总RNA TRIzol提取液系美国Promega公司产品；cDNA第一链合成试剂盒系美国Fermentas公司产品；DNTPs系美国Promega公司产品；Taq DNA聚合酶系晶美生物制品公司产品；引物系上海生工生物工程公司合成。其他生化试剂均为国产或进口分析纯。
1.4 检测方法
1.4.1 外周血单核细胞分离
每个实验对象抽取5mL静脉血，肝素抗凝，用常规密度梯度离心法分离外周血单核细胞，用预冷的生理盐水洗3遍后，迅速放入-70℃冰箱冻存备用。
1.4.2 RNA的提取及RT PCR
用细胞总RNA TRIzol提取液提取总RNA。1μg总RNA进入逆转录体系转录合成cDNA，然后用DcR3、CEA、β actin基因的特异性引物进行扩增。DcR3基因引物顺义链为 5′TCAATGTGCCAGGCTTTC3′，反义链为5′GCCTCTTGATGGAGATGTCC3′；CEA基因引物顺义链为5′TAGCTACTTACTTACTACTCCT 3′， 反义链为5′CTTTTGTCCCGGCACATCGGGC3′； β actin基因引物顺义链为 5′TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA3′， 反义链为5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG3′。取1μL逆转录产物进入PCR体系，在PCR仪内94℃预变性5min，94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 2min共37个循环，最后72℃延长5min，分别扩增DcR3、CEA和β actin基因片段。
1.4.3 PCR产物的相对定量分析
6μL PCR产物经15g/L(1.5%)的普通琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙啶染色，通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析，把DcR3和CEA与β actin的比值作为DcR3和CEA基因的相对表达水平进行比较。
1.5 统计学处理
DcR3和CEA基因的相对表达水平数据以±s表示，结肠癌患者与健康人比较采用t检验。
2 结 果
结果显示，结肠癌患者和健康对照组外周血中均检测到DcR3基因的表达，而健康人未检测到CEA(图1、图2)。PCR产物电泳后在144bp和131bp大小位置均见有一清亮条带，与预计的DcR3和CEA基因片段大小一致，同时在660bp大小位置也显示有清亮条带，此为内参照基因β actin片段产物。DNA条带和强度分析显示，结肠癌患者外周血中DcR3基因呈过度表达，其相对表达水平为0.415±0.078，而健康对照组外周血中DcR3基因有低水平的表达,其相对表达水平为0.235±0.074，两者相比有显著性差异(P<0.05)。而CEA在结肠癌患者外周血中阳性率为36.4%(16/44)，表达水平为0.346±0.071。30名健康志愿者为阴性(表1)。表1 DcR3和CEA基因的表达水平（略）
3 讨 论
本研究对44例结肠癌患者和30名健康志愿者进行了外周血中DcR3基因mRNA表达水平的检测，发现结肠癌患者外周血中DcR3基因表达明显高于正常人群。说明DcR3基因异常表达与结肠癌有一定的关系。尽管结肠癌病因及发病机制尚未完全明了，但是目前认为其发病机制主要与免疫逃逸有关[7]。Fas/FasL通路在肿瘤免疫和自身免疫中，尤其在免疫系统凋亡调节中起关键作用。Fas/CD95为Ⅰ型膜蛋白，主要以m Fas(膜受体)形式广泛分布于活化T、B细胞、单核细胞及多种肿瘤细胞表面，通过与其配体FasL(死亡因子)交联而介导表达Fas的细胞凋亡。Fas基因的不同拼接产生s Fas(可溶性Fas)，对m Fas诱导的凋亡有抑制性调节作用。DcR3是一个含300个氨基酸的蛋白质，在肺癌、结肠癌细胞中高度表达，在外周血单核细胞中也可检测到DcR3基因的表达。研究发现DcR3几乎完全阻断了FasL与Fas的结合，基本抑制了成熟T淋巴细胞，并以剂量依赖性方式阻断FasL诱导的Jurkat T白血病细胞凋亡，减少NK细胞对Jurkat T白血病细胞的杀伤[8]。因此，在肿瘤、自身免疫性疾病的发生、中可能起一定的作用。本研究表明，结肠癌患者外周血中DcR3基因的过度表达，与健康人相比有统计学意义。提示高度表达的DcR3可能与结肠癌有相关性。但是，目前尚无资料证明DcR3基因过度表达必然引起结肠癌，亦无证据表明结肠癌相关致病因子能影响DcR3基因的表达。因而，仍不能明确DcR3过度表达是否参与结肠癌的发病，或者仅仅是伴随的表现。我们仍需深入研究DcR3基因表达的影响因素，来确定其与结肠癌的关系。CEA的水平随疾病的病程进展而相应的升高。因此，它已经被当作一种独立的预后指标。尽管不是绝对特异，但因部分结肠癌的细胞分泌大量CEA且在血浆中可以检测的事实，使得CEA成为非常重要的肿瘤标志物之一。但是CEA对结肠癌没有筛选作用，因为其既不敏感，又无特异性。而本研究结果中CEA在结肠癌患者外周血中阳性率为36.4%(16/44)，表达水平为0.346±0.071。30名健康志愿者均为阴性。因此，我们期望在CEA阴性情况下，DcR3可能成为新的肿瘤标志物。
【】
/[1/]Ruo L, Guillem JG. Major 20th?century advancements in the management of rectal cancer /[J/]. Dis Colon Rec Tum, 2002, 42:563?569.
/[2/]Kwon GY, Jeong J, Woo JK, et al. Co?expression of bfl?1enhances host response in the herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy system /[J/]. Biochem Biophys Re Commun, 2003,303(3):756?763.
/[3/]Pitti RM, Marsters SA, Lawrence DA, et al. Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer /[J/]. Nature, 1998, 396(6712):699?703.
/[4/]Gold Pretman SO. Demonstration of tumor specific antigens in human colonic carcinoma by immunologicaltolerance and absorption techniques /[J/]. J Exp Med, 1965,121:439?446.
/[5/]刘晓玲，汪涛，王雯，等. SCC2Ag、CEA在肺癌患者血清中的表达及临床意义 /[J/]. 西安大学学报(医学版), 2004, 25(5):468?469.
/[6/]罗素霞，马保根，陈小兵，等. LTA、CYFRA212、NSE和CEA联合检测对肺癌诊断及病理分型的价值 /[J/]. 郑州大学学报(医学版), 2005, 40(6):1125?1127.
/[7/]Bai C, Connolly B, Metzker ML, et al. Overexpression of M68/DcR3 in human gastrointestinal tract tumors independent of gene amplification and its location in a four?gene cluster /[J/]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(3):1230?1235.
/[8/]Alderson MR, Tough TW, Davis?Smith T, et al. Fas ligand?induced murine pulmonary inflammation is reduced by a stable decoy receptor 3 analogue /[J/]. Immunology, 2003, 110(2):225?233.
