单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化损伤及修复

【关键词】  单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复

　　摘要：目的  观察小鼠成纤维细胞由过氧化氢(H2O2)引起的DNA损伤及其修复，并详细介绍单细胞凝胶电泳技术。方法  培养NIH3T3细胞，H2O2造成细胞氧化损伤，单细胞凝胶电泳技术(SCGE，Comet Assay)检测细胞DNA的损伤情况。结果  ①建立了H2O2致NIH3T3细胞DNA损伤的分级图谱；②H2O2引起的小鼠成纤维细胞DNA单链断裂与H2O2的浓度呈依赖性关系；③细胞在除去H2O2后15min已出现明显修复，多数修复可在1h内完成，但少数修复可能需要较长时间才能完成。结论  单细胞凝胶电泳技术是一种简便、敏感的检测DNA氧化损伤的方法。

　　关键词：单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复

　　Oxidantinduced DNA damage and the reparation　in NIH3T3 mouse fibroblasts by single cell gel electrophoresis

　　ABSTRACT: Objective  To study H2O2induced single strand breaks(SSB) formation in DNA and the reparation in NIH3T3 mouse fibroblasts by single cell gel electrophoresis technique (SCGE, Comet Assay) and to introduce SCGE. Methods  The NIH3T3 mouse fibroblasts were incubated, and cell damage was induced by H2O2 and determined by SCGE. Results  ① H2O2induced damage class graph of the DNA Comet in the NIH3T3 mouse fibroblasts was established. ② H2O2induced SSB was H2O2 dosedependent. ③ The reparation of the damaged DNA was timedependent and could be achieved 15min after incubation. The data indicated that most reparations were completed within 1 hour, but a few might take longer time. Conclusion  Single cell gel electrophoresis technique is a simple and sensitive method to determine oxidationinduced single strand breaks(SSB) formation in DNA.

　　KEY WORDS:single cell gel electrophoresis technique(SCGE); single strand breaks(SSB); oxidantinduced DNA damage; DNA reparation

　　许多资料显示染色体的诱变、肿瘤的形成以及衰老都与DNA损伤相关联[1]。观察药物对DNA氧化损伤及修复的影响，对全面阐述药物抗氧化作用以及探讨药物的作用机理具有重要意义。目前检测DNA损伤的方法主要有：①用高效液相色谱法检测细胞、组织或尿液等体液中DNA碱基修饰的代谢产物8羟基鸟嘌呤[2]；②用单细胞凝胶电泳技术(SCGE, Comet Assay)检测细胞的DNA损伤[34]。作者在日本研修期间用单细胞凝胶电泳技术在小鼠成纤维细胞上观察了由H2O2引起的DNA的损伤及其氧化损伤后DNA的修复，现将这种方法及实验结果介绍如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  药品试剂  细胞培养介质 DMEM和小牛血清(FBS)购自Sigma公司；细胞培养平皿为Coring公司产品；Comet Assay试剂盒购自Trevigen公司。

　　1.2  细胞培养及H2O2损伤方法  DMEM培养液中加入10%(体积分数)小牛血清(FBS)、青霉素和链霉素各100u/mL。 NIH小鼠成纤维细胞(NIH3T3)用该培养液调整至3.3×104个细胞/mL的细胞悬液，将细胞接种于直径35mm的培养皿(3mL/皿)，于37℃、5%(体积分数)CO2的细胞培养箱中培养24h。置换成不含小牛血清的DMEM，在培养皿中加入H2O2使终浓度分别为0.3-0.5mmol/L，培养15min。再次置换成新鲜的含10%(体积分数)小牛血清的DMEM，分别于H2O2处理后即刻、15、30、60、120min收集细胞进行单细胞凝胶电泳分析。

　　1.3  单细胞凝胶电泳(Comet Assay)  本方法的原理是先将细胞固定在葡聚糖凝胶中，用碱(0.3mol/L NaOH)将DNA变性，然后使DNA裂解所形成的片段在电场中迁移，没有受损伤的DNA，因分子较大迁移较慢保留在原来核的位置，而受损伤的DNA则被裂解成较小的片段而发生明显的迁移，DNA被荧光染色后在荧光显微镜下观察，可见裂解的DNA片段形成象彗星一样的长尾，根据“彗尾”的形状、亮度、尾长评价DNA的损伤。收集的细胞与10g/L低熔点葡聚糖凝胶(保温在40℃，pH 10，PBS溶解)混合。将此细胞悬液铺敷于预先已铺设了一层1g/L葡聚糖凝胶的玻片上，玻片在4℃放置10min后，被置于溶胞液中[2.5mol/L NaCl、100mmol/L EDTA、10mmol/L Tris、1%(体积分数)TritonX100，pH= 10]4℃，60min。然后水平地置于裂解液中(0.3mol/L NaOH、1mmol/L EDTA，pH>13)4℃，20-40min，TBE缓冲液洗两次，每次5min。于TBE缓冲液中电泳10min(1V/cm)，乙醇脱水，干燥，滴加SYBR Green于凝胶层上，在荧光显微镜下观察细胞形成的DNA彗尾。

　　1.4  DNA彗尾级别的记录  根据DNA损伤后形成的荧光彗尾的形状、头的亮度及尾的长度将其分为5个级别，以表示DNA损伤的程度。根据预先制成的标准图谱(图1)，每个样品记录100个细胞的DNA彗尾的级别填入表1，并样品各级分布的百分频率和AU(arbitrary units)。AU的计算：DNA彗尾级别从0-4级分别被规定其AU为0、100、200、300、400，每个样品的AU=∑各级分布频率×各级单位数。

　　表1  Comet Assay样品DNA彗星的级别百分频率分布表和AU单位（略）

　　Table 1  The frequency percentage of DNA Comet on the class and arbitrary units on the sample

　　举例：样品1  AU=60%×0+30%×100+10%×200=50(AU)

　　　　　样品2  AU=20%×100+60%×200+10%×300+10%×400=210(AU)

　　2  结果

　　2.1  小鼠成纤维细胞DNA损伤的分级图谱  我们首先获得了NIH3T3细胞氧化损伤的分级图谱(图1)。我们体会制作图谱并以图谱为分级标准评价DNA的损伤时，既要考虑彗尾的长度亦要兼顾考虑彗头的亮度、大小，这样评价才比较客观全面，最好是由同一人做评分。根据资料分析，不同的细胞、不同的损伤条件及实验条件，形成的“彗尾”可能不一样，所以确定实验条件并制备标准图谱是不同条件下实验的第一步。

　　图1  NIH3T3小鼠成纤维细胞氧化损伤的DNA彗星分级图谱（略）

　　Fig.1 Damage class graph of the DNA Comet in the NIH3T3 rat fibroblasts (for Comet Assay)

　　2.2  H2O2引起的小鼠成纤维细胞DNA单链断裂与H2O2的浓度相关  由图2可见H2O2处理所用浓度愈高，DNA损伤分级单位愈高，指示损伤愈严重；样品的各级分布百分频率图(图3)亦显示，随着H2O2浓度升高，样品中彗尾为3级、4级的分布百分频率升高。

　　图2  H2O2引起的NIH3T3细胞DNA氧化损伤（略）

　　Fig.2 H2O2induced DNA oxidative damage in the NIH3T3 fibroblasts (±s)

　　图3  H2O2引起的NIH3T3细胞DNA氧化损伤的彗星级别分布（略）

　　Fig.3 The class frequency percentage of Comet of H2O2induced DNA damage in the NIH3T3 fibroblasts(±s)

　　2.3  H2O2致小鼠成纤维细胞DNA单链断裂后的修复  由图4可以看出H2O2处理后细胞DNA的单链断裂，在除去H2O2后15min已出现明显修复，且随时间的延续修复愈加显著，1h时已完成50%以上修复，但2h时还没有完全修复。提示多数修复可在1h内完成，但少数修复可能需要较长时间才能完成。样品的各级分布百分频率图(图5)亦显示，随着修复时间的延续，样品中彗尾为1级的分布百分频率升高。

　　图4  H2O2引起NIH3T3细胞DNA的氧化损伤及修复（略）

　　Fig.4 Reparation of H2O2induced DNA damage in the NIH3T3 fibroblasts (±s)

　　图5  H2O2引起NIH3T3细胞DNA氧化损伤及修复的彗尾级别分布（略）

　　Fig.5 The class frequency percentage of Comet of H2O2induced DNA damage in the NIH3T3 fibroblasts(±s)

　　3  讨论

　　目前，检测DNA氧化损伤代谢产物8羟基鸟嘌呤的分析方法用得最多的是高效液相色谱电化学检测法(HPLCEC)和气相色谱质谱检测法(GCMS)，但这两种检测方法在定量方面仍有不足。已有报道用GCMS法测得DNA中8羟基鸟嘌呤的量比用HPLCEC法高2-11倍，用GCMS法测定8羟基鸟嘌呤不太准确[3]。单细胞凝胶电泳技术是一种简便、快速、敏感、非放射性的检测DNA损伤的方法，对观察细胞全部DNA损伤情况提供了直观的信息，可以获得细胞DNA损伤的整体状况，对评价DNA损伤和细胞自身DNA修复能力，或评价其他介入因素的作用是一个较好的方法[4]，可以获得药物对DNA分子损伤及修复影响的有价值的信息。与高效液相色谱法比较，本方法有表达DNA损伤的整体信息直观、所需仪器设备简单的优点，但该方法用目测评价DNA损伤的级别容易引入误差是其主要的缺点。配合机图象分析技术分析评价“彗尾”的级别将克服这一缺点。氧化造成的DNA损伤与衰老、突变以及肿瘤形成密切有关。许多研究证实，中药及其有效成分的抗衰老、抗肿瘤、心脑血管疾病的临床疗效与其抗氧化活性密切相关，但有关中药对DNA保护方面的研究工作开展很少。相信单细胞凝胶电泳技术在探索中药及其有效成分对DNA分子的影响，以及探索中药抗氧化作用机理方面会得到更多地应用。

　　：

　　[1]Visioli F, Grande S, Bogani P, et al. The role of antioxidants in the Mediterranean diets: focus on cancer [J]. Eur J Cancer Prev, 2004,13(4):337343.

　　[2]蔡凌霜,曾昭睿,吴采樱. DNA氧化损伤产物及其检测方法 [J]. 分析测试学报, 2001, 20(5):8893.

　　[3]Mihalis P, Orestes T, Dimitrios G. Glucose oxidaseproduced H2O2 induces Ca2+dependent DNA damage in human peripheral blood lymphocytes [J]. Free Radical Biol Med, 1999, 26(56):548556.

　　[4]Duez P, Dehon G, Kumps A, et al. Statistics of the Comet assay: a key to discriminate between genotoxic effects [J]. Mutagenesis, 2003, 18(2):159166.