柴胡总皂甙对戊四氮慢性点燃大鼠海马γ

【关键词】  柴胡总皂甙；戊四氮；癫痫；γ

　　摘要：目的  研究柴胡总皂甙对戊四氮(PTZ)慢性点燃癫痫模型大鼠海马区γ氨基丁酸(GABA)表达的影响。方法  48只健康SD大鼠被随机均分为6组，即空白对照组(A组)、生理盐水组(B组)、丙戊酸钠(VPA)组(C组)和柴胡总皂甙高、中、低三种剂量组(D组、E组、F组)。除A组不做处理外，其他各组采用腹腔注射PTZ慢性点燃造模，造模同时给予VPA、柴胡总皂甙等不同处理因素，连续4周后取脑组织切片进行GABA免疫组化染色，从阳性细胞数、灰度值分析结果。结果  B组海马CA1、CA2、DG区的阳性细胞数高于其他各组(P<0.05)，而各区阳性细胞灰度值低于其他各组(P<0.05)。结论  柴胡总皂甙可以影响PTZ点燃大鼠海马的GABA水平，发挥抑制PTZ对大鼠点燃的作用。

　　关键词：柴胡总皂甙；戊四氮；癫痫；γ氨基丁酸；大鼠

　　Effect of saikosaponin on GABA of hippocampus of chronic　kindling induced by pentylenetetrazol in rats

　　ABSTRACT: Objective  To study the effect of active ingredients (saikosaponin) of bupleurum chinensis D C. on GABA of hippocampus of chronic kindling induced by pentylenetetrazol (PTZ) in rats. Methods  Fortyeight healthy SpragueDawley rats were randomly divided into six groups with eight in each group: normal control (Group A), normal saline (NS) group(Group B), sodium valproate (VPA) group(Group C), group of largedose saikosaponin (Group D), group of mediumdose saikosaponin (Group E), and group of smalldose saikosaponin (Group F). Except Group A to be controlled, the other groups were given different treatments when chronically kindled by PTZ. The process of the test lasted for 4 weeks. After 4 weeks administration the brain tissues were sampled, sliced and stained by enzyme immunohistochemistry(EIH). The results were analyzed according to the positive cell population and gray value. Results  The positive cell population of CA1, CA2 and DG in group B was significantly different from that in the other groups(P<0.05). The gray value of CA, CA2 and DG in group B was significantly different from that in the other groups (P<0.05). Conclusion  Saikosaponin can influence GABA of hippocampus of rats ,and inhibit chronic kindling effect induced by PTZ.

　　KEY WORDS: saikosaponin; pentylenetetrazol; epilepsy; GABA; rat

　　人类癫痫及痫性疾病大约占人口的1%-5%，其中约20%的患者对现使用的药物存在耐药性[1]，给带来很大难度，临床需要新的抗癫痫药物。本课题组前期提出柴胡总皂甙能有效对抗戊四氮(PTZ)慢性点燃致痫作用，影响致痫大鼠脑电活动[2]，并能抑制大鼠海马星形胶质细胞的异常激活[3]。在本研究中我们继续探讨柴胡总皂甙对慢性点燃大鼠海马γ氨基丁酸(GABA)阳性细胞变化的影响，为柴胡总皂甙抗癫痫机制提供更多的实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组  SPF级SpagueDawley(SD)大鼠48只，体重(200±20)g，雌雄各半,购自南方医科大学实验动物中心(动物合格证号：2004B023)，饲养于南方动物所。大鼠随机分为6组，每组8只(雌雄各半)：A组为空白对照组，B组为生理盐水组，C组为丙戊酸钠(VPA)组，D、E、F组分别为柴胡总皂甙高、中、低剂量组。

　　1.2  药品、试剂与仪器  柴胡总皂甙粉购自上海医药研究院，批号050106； VPA为湖南湘中制药有限公司生产，批号050123；PTZ为Sigma公司生产，批号 064K0686；兔抗GABA及SABC免疫组化染色试剂盒购自博士德公司；切片机为Leica公司产品。采用PLA6XX Camera kit图像获取系统及Image tool 3.0图像分析软件。

　　1.3  方法

　　1.3.1  药液配制  应用生理盐水准确配制PTZ溶液(32.50g/L)及柴胡总皂甙高、中、低3种质量浓度溶液(分别为15.60g/L、7.80g/L、3.90g/L)和VPA溶液(17.50g/L)，冷藏备用。40g/L多聚甲醛-0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.3)和PBS溶液临用前配制。

　　1.3.2  PTZ慢性点燃癫痫大鼠造模及处理  各组均选用灌胃法给予处理。A组与B组给予等容积生理盐水；C组按87.5mg/kg给予VPA溶液；D组、E组和F组分别按照156、78、39mg/kg给予柴胡总皂甙溶液。每日上午8时左右给药，给药1h后，A组按10mL/kg生理盐水腹腔注射，其他各组按32.5mg/kg腹腔注射PTZ溶液，每日1次，连续4周。腹腔注射PTZ溶液后观察记录大鼠痫性发作级别[2]。痫性发作分级采用Racine标准[4]，即0级：无发作反应；1级：节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛；2级：点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛；3级：出现前肢阵挛但不伴随直立；4级：前肢阵挛伴随直立；5级：全身强直阵挛发作而跌倒。凡连续至少5次2级以上痫性发作大鼠被认为慢性点燃致痫成功。

　　1.3.3  GABA免疫组化染色  4周实验结束时，按常规制备大鼠海马石蜡切片，片厚3μm[3]。切片常规脱蜡、水化，3%(体积分数)H2O2去离子水孵育10min。热修复后，滴加抗原修复液1(ARS1)，室温10min，蒸馏水冲洗2min×3；滴加5%(体积分数)BSA(bovine serum albumin)封闭液，室温10min，滴加一抗(兔抗GABA稀释度为1∶100)4℃过夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 20min。上两步之间用PBS冲洗，2min×3次。滴加试剂SABC(链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物)，20-37℃ 20min，PBS冲洗，5min×4次；应用新鲜配制DAB显色，10min后水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

　　1.3.4  GABA阳性细胞计数及灰度值检测  应用OLYMPUS BH2型光学显微镜，高倍视野下(×400)随机观察CA1、CA2、齿状回(DG)区的GABA阳性细胞数(每个区选择3个视野，均值)，运用PLA6XX Camera kit系统获取图片，并进一步用Image tool 3.0图像分析软件分析细胞平均灰度值(每个阳性表达细胞的平均灰度值分为256度，最黑者为0度，最亮者为255度)。

　　1.4  统计学处理  数据采用±s表示，应用SPSS 10.0统计软件。计量资料的比较用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  各组海马CA1、CA2、DG区GABA阳性细胞数的比较  在CA1区，GABA阳性细胞数以B组最多，与其他5组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。在CA2区和DG区，GABA阳性细胞数也以B组最多，除F组外其余各组与其比较均有显著性差异(P<0.05或P<0.01，表1、图1)。提示在大鼠海马CA1、CA2、DG各区，经PTZ慢性点燃后GABA阳性细胞数量明显增多，经柴胡总皂甙和VPA处理后，大鼠海马各区的GABA阳性细胞数量较模型鼠(生理盐水组)明显减少，接近于空白对照组，柴胡总皂甙高剂量组尤为明显。

　　表1  柴胡总皂甙对海马CA1、CA2、DG区GABA阳性细胞数的影响（略）

　　Table 1  The effect of saikosaponin on positive cells of GABA in CA1, CA2 and DG of hippocampus

　　A: normal control group; B: normal saline group; C: sodium valproate group; D: group of largedose saikosaponins; E: group of mediumdose saikosaponin; F:group of smalldose saikosaponin

　　△ The cases less than eight were lost during the experiment of EEG

　　*P<0.05, **P<0.01 vs. group B

　　2.2  各组海马CA1、CA2、DG区GABA阳性细胞平均灰度值的比较及图片分析  在CA1和CA2区，GABA阳性细胞的灰度值以B组最低，与A、C、D、E组比较有显著性差异(P<0.05)。在DG区也以B组灰度值最低，与A、C、D组比较有显著性差异(P<0.01，表2)。结合图1，大鼠海马GABA免疫反应阳性细胞分布广泛，细胞胞浆均匀染色，在各组均有表达。B组大鼠海马GABA阳性细胞呈线状排列，胞浆深染，说明B组阳性细胞染色深于其他各组，提示胞浆内GABA含量增加。

　　图1  柴胡总皂甙对海马区GABA阳性细胞表达的影响（略）

　　Fig.1 The effect of saikosaponin on positive cells of GABA in hippocampus (×400)

　　A: group A (normal control group); B: group B (normal saline group); C: group C (sodium valproate group); D: group D (group of largedose saikosaponin); E:group E (group of mediumdose saikosaponin); F: group F (group of smalldose saikosaponin)

　　表2  柴胡总皂甙对海马CA1、CA2、DG区GABA阳性细胞平均灰度值的影响（略）

　　Table 2  The effect of saikosaponin on gray value of positive cells of GABA in CA1, CA2 and DG of hippocampus

　　▲ the same as the group in Table 1

　　△ The cases less than eight were lost during the experiment of EEG

　　*P<0.05, **P<0.01 vs. group B

　　3  讨论

　　癫痫在祖国医学中属“痫病”范畴，《内经》中记载“木郁之发，太虚埃昏，云物以扰，大风乃至……目不识人，善暴僵仆”。《三因极一病证方论》也说“夫癫痫病，皆由惊动，使脏气不平，郁而生涎，闭塞诸经，厥而乃成。”可见肝气暴郁、肝风动摇是痫病的病机之一。从肝论治为其重要治则之一[5]，临床上柴胡桂枝汤、柴胡加龙骨牡蛎汤、柴胡疏肝汤等抗癫痫取得了较好疗效，其君药柴胡在临床与动物实验中亦有明显的抗癫痫作用，柴胡总皂甙是柴胡的主要成份，能有效对抗PTZ的致痫作用。GABA是脑内最重要的抑制性递质之一，大脑中约有40%的突触属GABA能。GABA的抑制功能至少有两种主要的受体参与，即GABAA和GABAB受体。GABA经突触前神经末梢合成后分泌释放进入突触间隙，与突触后膜上的GABAA受体结合后，Cl-通道开放，引起突触后膜超极化，产生抑制性突触后电位(IPSP)，抑制神经元的兴奋性。当GABA与GABAB受体结合后，增加细胞膜K+的通透性，降低了Ca2+的内流，从而也降低了神经元的兴奋性。因而GABA与癫痫的发病有密切关系。本研究结果提示，经PTZ慢性点燃后大鼠海马各区GABA阳性细胞的数量明显增多，阳性细胞内GABA含量明显增加；而经柴胡总皂甙和VPA处理后，海马各区GABA阳性细胞数量较生理盐水组明显减少，阳性细胞内GABA含量较生理盐水组明显降低，接近于空白对照组，VPA和柴胡总皂甙高剂量组尤为明显。其GABA的变化似乎与癫痫的发病有矛盾之处，因为许多研究都指出癫痫的发生与GABA抑制神经元兴奋性的作用降低有关，然而Ding[6]采用微透析技术研究大鼠海马区GABA及Glu含量，发现CA1区、CA3区细胞外GABA水平在给予海人酸后升高并存在动态变化，CA3区相同区域和苔状纤维GABA免疫反应性显著增加。Cavalheiro[7]等也报道，在匹罗卡品致痫模型的慢性期，GAD的活性增加，细胞外所有的氨基酸水平均增加。对人脑组织中的GABA和谷氨酸变化的研究，同样显示了惊厥前细胞外Glu浓度是增高的，而GABA降低；在惊厥期间，Glu浓度持续增高并达到潜在的神经毒性浓度，GABA浓度也增加，在非癫痫灶侧海马增加幅度更大[8]。动态检测PTZ急性致痫大鼠海马细胞外液GABA的浓度，发现发作期较发作前明显下降，在发作后3d 则升高[9]。以上结论与本研究有类似之处，说明在实验性癫痫发生过程中，脑内GABA的变化是动态的，尤其在慢性点燃过程中GABA的变化更为复杂。这可能与癫痫发生发展过程中GABA能神经元抑制功能代偿性增加或GABA能“去抑制”有关[7，10]。另有研究显示，GABA可能在发育早期存在兴奋性作用[11]。PTZ慢性点燃后，GABA阳性细胞异常增多，内源性释放GABA可能增加，而此时GABA的释放易诱发动作电位，且动作电位可被GABA受体阻滞剂阻断[12]。另外也有人发现GABA可以激活兴奋性中间神经元，从而使体外培养的海马神经元产生癫痫类似的后发放[13]。因此癫痫发病机制中，脑内GABA及其神经元的功能变化是复杂的。柴胡总皂甙对PTZ慢性点燃大鼠的痫性发作及慢性点燃过程均有明显的抑制作用[2]。本研究结果表明柴胡总皂甙对大鼠海马GABA阳性细胞表达存在明显的抑制作用，其抗实验性癫痫的作用机制可能与影响PTZ慢性点燃大鼠海马GABA的水平有关。是减弱了GABA能神经元抑制功能代偿性增加，还是避免了“去抑制”的发生，以及如何影响谷氨酸的变化，尚有待进一步研究。

　　：

　　[1]Haberek G, Tomczyk T, Urbanska EM. Previous prolonged clonic seizures diminish antiepileptic activity of valproate against pentetrazolevoked convulsions [J]. Pol J Pharmacol, 2001,53:8182.

　　[2]谢炜，鲍勇，于礼建，等. 柴胡总皂甙对PTZ慢性点燃大鼠痫性发作及脑电图的影响 [J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(2):177180.

　　[3]谢炜，鲍勇，于礼建，等. 柴胡总皂甙对戊四氮慢性点燃大鼠海马内GFAP表达的影响 [J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(4):452455.

　　[4]Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. Ⅱ. Motor seizure [J]. Electroenceph Clin Neurophysiol, 1972, 32:281294.

　　[5]黄运生，陈宝田. 癫痫从肝论治柴胡疏肝汤癫痫108例疗效分析 [J]. 实用中医内科杂志, 2005,19(1):45.

　　[6]Ding R, Asada H, Obata K. Changes in extracellular glutamate and GABA levels in the hippocampal CA3 and CA1 areas and the induction of glutamic acid decarboxylase67 in dentate granule cells of rats treated with kainic acid [J]. Brain Res, 1998,800(1):105113.

　　[7]Cavalheiro EA, Fernandes MJ, Turski L, et al. Spontaneous recurrent seizures in rats: amino acid and monoamine determination in the hippocampus [J]. Epilepsia, 1994, 35 (1):111.

　　[8]During MJ, Spencer DD. Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain [J]. Lancet, 1993, 341:16071610.

　　[9]徐元,包仕尧,张志琳,等. 癫痫大鼠海马细胞外液中γ氨基丁酸、谷氨酸、牛磺酸及甘氨酸的动态变化 [J]. 苏州大学学报(医学版), 2005,25 (3):370373.

　　[10]Buckmaster PS, JongenRelo AL, Davari SB, et al. Testing the disinhibition hypothesis of epileptogenesis in vivo and during spontaneous seizures [J]. J Neurosci, 2000, 20(16): 62326240.

　　[11]潘斌，杨东伟，韩太真，等. γ氨基丁酸在发育期大鼠视皮层长时程增强中的作用 [J]. 西安大学学报(医学版), 2004, 25(4):313315.

　　[12]Dzhala VI, Staley KJ. Excitatory actions of endogenously released GABA contribute to initiation of lactal epileptiform activity in the developing hippocampus [J]. J Neurosci, 2003, 23(5):18401846.

　　[13]Isomura Y, FujiwaraTsukamoto Y, Takada M. Glutamatergic propagation of GABAergic seizurelike afterdischarge in the hippocampus in vitro [J]. J Neurophysiol, 2003, 90:27462751.