EB1基因表达与胚胎染色体数目异常的关系
作者：刘青松，翁亚光，杨戎，施琼，蔡燕，刘子杰，徐远久，蒋宏彦
【摘要】 目的 研究EB1基因在胚胎绒毛细胞中的表达，并分析其对染色体分离的影响。方法 采用荧光定量PCR技术检测EB1基因在人工流产绒毛核型分析正常的胚胎细胞和流产绒毛核型分析异常的胚胎细胞中的表达差异；免疫组织化学方法检测EB1蛋白在两者中的表达情况，并用Western blot加以验证。结果 EB1基因mRNA拷贝数/GAPDH基因mRNA拷贝数的均值在人工流产绒毛核型分析正常的胚胎细胞中为0.01004±0.008223，在自然流产绒毛核型分析异常的胚胎细胞中为0.1509±0.0633。Western blot和免疫组织化学结果表明其在自然流产绒毛核型分析异常胚胎细胞中的表达也高于其在人工流产绒毛核型分析正常胚胎细胞中的表达。经统计分析，EB1基因mRNA水平和蛋白水平在上述两组细胞中的表达均有显著差异。结论 EB1基因在自然流产绒毛核型分析异常的胚胎细胞中的表达明显高于其在人工流产绒毛核型分析正常的胚胎细胞中的表达，其高表达可能导致染色体分离异常。
【关键词】 EB1基因；染色体；胚胎
The relationship of EB1 gene expression with chromosome number abnormity embryo
ABSTRACT: Objective To investigate EB1 expression in embryonic cells and analyze the effect of EB1 on chromosome segregation. Methods Endogenous EB1 mRNA and protein levels in embryonic cells of trophonema from artificial abortion and spontaneous abortion were compared, using fluorescence quantitative PCR, immunohistochemistry and western blot, respectively. Results Mean ratios of EB1 mRNA/GAPDH mRNA were 0.0100±0.0082 and 0.1509±0.0633, respectively. The protein level of EB1 was higher in the former than the latter. Conclusion The expression of EB1 is significantly higher in embryonic cells of trophonema from spontaneous abortion than from artificial abortion, and the increased expression of EB1 may lead to abnormality of chromosome segregation.
KEY WORDS: EB1 gene; chromosome; embryo
染色体是细胞内维持遗传物质稳定和保证其完整、准确传递的基本结构。在细胞分裂过程中，染色体的正常分离受到多种基因的严密监控，以保证细胞分裂的正常进行。纺锤体微管与染色体的连接是保证染色体正常分离的前提，同时，只有在细胞分裂的中期所有染色体与纺锤体微管连接并排列在细胞赤道面时，细胞中的染色体才能正常地向细胞的两极移动并进入两个子细胞。有研究表明微管末端结合蛋白在微管生长、稳定及与细胞器的连接方面起到重要的作用。EB1是一种微管末端结合蛋白，位于生长中的微管正端，与结肠腺瘤病(adenomatous polyposis coli, APC)蛋白相互作用起到连接微管与细胞皮层及染色体的作用[1]。EB1的这些功能对于中心体的定位和染色体分离具有潜在的作用。基于此点，本研究比较分析EB1在人工流产绒毛核型分析正常的胚胎细胞和自然流产绒毛核型分析异常的胚胎细胞中mRNA和蛋白的表达情况，并初步探讨EB1基因表达与胚胎染色体数目异常的关系。
1 材料与方法
1.1 菌种 菌种为JM109，来自重庆医科大学临床检验诊断学部重点实验室。
1.2 主要试剂和仪器 DMEM和RPMI1640培养基由临床检验诊断学教育部重点实验室供应室自行配制；CK抗体和波形蛋白抗体购自北京中山公司；质粒大抽试剂盒EndoFreePlasmid Maxi Kit购自QIAGEN公司；定量PCR所用探针由上海Genecore合成；特优级血清购自Hyclon公司；EB1蛋白一抗购自Santa cruz公司；免疫化学试剂盒购自北京中山生物试剂公司；Omniscript Reverse Transcriptase试剂盒购自QIAGEN；Platinum Taq polymerase和T载体试剂盒购自TaKaRa公司；Biorad.电转仪、RT?PCR仪为美国MJ公司生产的Opticon Monitor2；FQ?PCR仪为美国IBA7000。
1.3 标本来源及分组 在重庆医科大学两所附属共获得45例人工流产、85例自然流产的胚胎组织(妊娠3个月内)，孕妇无有毒有害物质接触史。所有胚胎组织经过胚胎细胞原代培养，并进行染色体核型分析后，在其中筛选到33例人工流产染色体数目正常的胚胎(对照组)和28例自然流产染色体数目异常的胚胎(实验组)，分别提取总RNA，用于分析EB1基因的表达。用培养后剩余的组织分别提取总蛋白和进行石蜡包埋，进行EB1蛋白表达分析。
1.4 细胞的培养及鉴定 所有器械进行无菌处理后，立即对胚胎组织进行洗涤和分选，获取其绒毛组织。基础培养液是DMEM(低糖)，胎牛血清含量为20%(体积分数)，原代细胞培养7-10d进行传代，以后每次传代细胞的时间为3-4d。采用细胞免疫化学的方法，用CK7抗体鉴定绒毛滋养层细胞为阳性，而非滋养层细胞为阴性；相反波形蛋白抗体作为阴性对照，鉴定绒毛滋养层细胞为阴性，而非滋养层细胞为阳性，鉴定细胞为3-5代的细胞。
1.5 染色体标本的制备和分析 ①制备方法：培养3-5代的细胞收获前6-9h加入秋水仙素，按照常规方法制备染色体标本，对每个标本进行染色体分析。②染色体分析标准：在进行核型分析时，对人工流产滋养层细胞，当标本中出现染色体数目异常，但未见2个相同异常核型的标本，根据染色体数目分析的国际标准，这种异常主要是由于制片引起，而非组织细胞自身异常，该标本视为染色体正常；对自然流产滋养层细胞，当标本中染色体数目异常细胞较多，无法区分是由于制片原因还是组织细胞自身异常所致时，视为该标本染色体异常。实验结果显示，在自然流产滋养层细胞染色体数目异常有三倍体、四倍体、单个染色体增多和染色体缺失等几种情况，其中以三倍体(16例)和单个染色体增多(9例)为主。
1.6 FQ?PCR测定EB1基因mRNA水平
1.6.1 总RNA提取、逆转录和FQ?PCR ①1mL TRIZOL将约106个细胞充分匀浆，以氯仿、异丙醇抽提、沉淀，具体步骤按说明书进行。所得总RNA用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整性。②逆转录：总RNA 5μL和100μmoL/L oligo(dT)183μL，70℃变性5min，加入5μL 5×RT缓冲液、2μL 10mmol/L dNTP、25u Rnasin、200u M?MLV逆转录酶，加水致25μL混匀，42℃ 60min，最后70℃ 10min，产物用于PCR。③FQ?PCR反应体积为25μL，反应条件：94℃ 10min 1个循环；94℃ 30s，57℃ 1min 40个循环，在57℃ 1min处收集荧光。
1.6.2 EB1基因特异的引物和探针序列 EB?TAMRA?FAM：AGTTGTGCTCAGGGGCTGCGTATTGTC；EB?TAMRA?FP：GGATCAATGAGTCTCTGCAGTTGA；EB?TAMRA?RP：GGAGCCAGGGAACAGCATG，由上海基康生物公司合成。标准品用TA载体构建(TA载体试剂盒购自TaKaRa公司)，克隆序列为：GGATCAATGAGTCTCTGCAGTTGAATCTG?ACAAAGATCGAACAGTTGTGCTCAGGGGCTGC?GTATTGTCAGTTTATGGACATGCTGTTCCCTGG?CTCC。内参选用人的GAPDH基因，引物和探针购自上海基康生物公司。
1.7 免疫组织化学染色 采用SP法。石蜡块连续切片，厚度4μm，一抗工作浓度均为1∶100，详细步骤严格按照说明书进行。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照，以DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。阳性标准：以出现棕黄色颗粒为阳性，按染色深浅分组：阴性(-)：无染色；弱阳性(+)：浅染色；阳性(?)：中度染色；强阳性(?)：强染色。同时对结果进行半定量测定：对每张切片取3个视野，以视野数为单位，用HAIPS?1000高清晰彩色病理图像测量系统进行测量，选取阳性平均吸光度值(A值)为半定量参数，测定EB1蛋白的表达。
1.8 Western blot检测 分别从对照组和实验组胚胎组织中提取总蛋白，用蛋白提取液调整总蛋白含量约为1.0mg/L，每孔蛋白上样量为25μL，一抗浓度为1∶200，二抗为辣根酶标记兔抗羊IgG，滴度为1∶3000，采用DAB显色法。北京鼎国的预染marker，对提取的总蛋白做Western blot检测。
1.9 统计学处理 EB1基因mRNA水平表达结果和免疫组织化学平均阳性吸光度值结果用两个独立样本的t?test进行统计学处理；免疫组织化学阳性率用四格表资料的χ2检验。用SPSS12.0进行统计分析，α取0.001。
2 结果
2.1 RNA样品的鉴定 紫外分光光度计测定RNA的A260/A280比值在1.8-2.1之间，说明RNA有较高纯度，质量浓度为0.5-1.0mg/L。10g/L甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果显示RNA基本无降解，较完整(图1)。
2.2 EB1基因mRNA在胚胎细胞中的表达 EB1标准曲线公式：Y=34.56-2.96X(r=0.993)。每一样品做5个平行管，其荧光信号见图2。对照组和实验组EB1基因mRNA拷贝数与GAPDH基因mRNA拷贝数之比值分别为0.0100±0.0082(n=33)和0.1509±0.0633(n=28)，两者差异有统计学意义。
2.3 EB1蛋白在胚胎细胞中的表达 EB1蛋白在胚胎细胞胞桨和胞核中均有表达。对照组中的阳性、强阳性表达率为30.3%，实验组中的阳性、强阳性表达率为85.7%，两者差异有统计学意义(P<0.001，图3)。EB1蛋白平均阳性吸光度值在对照组和实验组中分别为21.33±10.76和45.40±13.47，两者差异有统计学意义(P<0.001)。
图1 总RNA凝胶电泳图（略）
Fig.1 Total RNA gel image
2.4 Western blot结果 对照组与实验组比较，EB1在流产胚胎组织中的表达明显高于人工流产胚胎组织中的表达，这与FQ?PCR的检测结果和免疫组化结果基本一致(图4)。
图2 定量PCR荧光信号检测图（略）
Fig. 2 Results of fluorescence signal by using FQ?PCR
图3 EB1蛋白的免疫组化染色（略）
Fig.3 Results of EB1 protein by using immunohistochemistry
A: weak expression of EB1 protein in embryonic cells of trophonema from artificial abortion; B: significant expression of EB1 protein in embryonic cells of trophonema spontaneous abortion
图4 EB1蛋白的Western blot结果（略）
Fig.4 Western blot image of EB1 protein
1: experimental group; 2: control group
3 讨论
染色体数目异常是由于细胞分裂时染色体分离异常所致，在流产胚胎中的发生率约3%，在自然流产胚胎中的发生率可高达50%。胚胎发育过程中细胞进行着旺盛的分裂，染色体正常分离是细胞分裂中一个十分重要的过程。微管是细胞骨架的主要成分之一，在细胞分裂、细胞迁移、细胞器运输和细胞极的确立起到重要作用。EB1是EB家族的3个成员之一，属于一种微管末端结合蛋白，可以位于生长中的微管的正端[2]。EB1蛋白在人类细胞中可以同APC蛋白发生相互作用，使APC结合到微管的末端[3]。EB1可能促进微管的“搜寻和捕获”及与保持染色体的稳定性有关[4]。研究表明，EB1具有延长微管的作用，EB1的高表达表明能加强微管的稳定性[5，7]。另外，有研究证明，EB1可以通过其C?端酪氨酸残基与CLIP170和CLIP115这两种微管末端结合蛋白发生相互作用，当EB1过量表达而均匀的沿着微管分布时，将减慢CLIPs的分裂[6]。最近有研究表明EB1可调节APC与β?catenin的相互作用[7]。β?catenin是WNT信号通路上的主要蛋白，而APC具有降低β?catenin的作用，从而阻断WNT信号通路的开启而防止肿瘤的发生，在胚胎细胞中，APC的这种功能表现为胚胎细胞分裂被抑制[8?9]。
我们从mRNA水平和蛋白水平对EB1在胚胎细胞/组织中的表达分析发现，EB1在染色体数目异常胚胎细胞/组织中的表达明显高于其在染色体数目正常的胚胎细胞/组织中的表达。我们推测：高表达的EB1指引微管向染色体方向生长的能力得到加强，微管附着到染色体着丝粒的能力也得到加强，但由于纺锤体微管牵引染色体向细胞两极移动的过程是通过纺锤体微管主动解聚，纺锤体微管缩短所至，因此当EB1表达增加，EB1稳定微管的作用得到加强，此时微管不易被解聚，使染色体不能因为微管的牵引作用而向细胞的两极移动(即细胞分裂后期延长)，导致细胞分裂障碍和染色体分离异常。另外，由于EB1具有调节APC和β?catenin的相互作用的功能，当EB1高表达时，可能加强了APC与β?catenin的相互作用，促进了β?catenin的降解，从而降低了胞浆中β?catenin的浓度，WNT信号通路受阻，细胞分裂受到抑制而导致染色体分离异常。我们的另一研究发现，APC在染色体数目异常胚胎中的表达高于染色体数目正常的胚胎，而且往往在同一标本中出现EB1和APC同时高表达现象，这也进一步说明了EB1和APC之间存在着紧密的相互关系。但是关于EB1对染色体分离的作用机制还有待更深入的研究。
基金项目：国家自然基金资助项目(No. 30371458)；重庆市科委重点项目(No. 渝科发计字[2004?47])
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