蛋白酶活化受体?1单克隆抗体的制备与鉴定
作者：马文静，何韶衡，周艳春，陈玉珍，黄阗，方泽漫，陈霖霏
【摘要】 目的 制备蛋白酶活化受体?1(PAR?1)单克隆抗体(mAb)。方法 以PAR?1特异性片段为免疫原(13肽)免疫BALB/c小鼠，运用杂交瘤技术制备抗PAR?1 mAb。采用捕获酶联免疫吸附试验(capture ELISA)鉴定mAb的Ig亚类；通过ELISA、Dot blot、免疫组化染色法、流式细胞仪分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性。结果 获得2株可稳定分泌抗PAR?1 mAb的杂交瘤细胞，其亚型分别为IgM、IgG2b。免疫组化染色表明，mAb与人扁桃体、结肠组织中的淋巴细胞、包皮组织中的成纤维细胞、肺组织中的巨噬细胞反应呈阳性。流式细胞仪分析显示，2株mAb与人肺腺癌细胞系A549细胞胞浆内及细胞膜上的PAR?1均呈阳性反应。激光共聚焦扫描显微镜观察，荧光标记的阳性反应物在A549细胞胞浆内及细胞膜上均可见。结论 成功地制备出抗PAR?1 mAb，为进一步研究炎症性疾病提供有用的试剂。
【关键词】 蛋白酶活化受体?1；单克隆抗体；酶联免疫吸附试验
Production and identification of monoclonal antibodies against proteinase activated receptor?1
ABSTRACT: Objective To produce and identify anti?PAR?1 monoclonal antibodies. Methods BALB/c mice were immunized with 13 amino acid peptide of PAR?1 and hybridoma cell lines were obtained by hybridoma technology. The specificity of mAbs was characterized by capture enzyme?linked immunosorbent assay (ELISA), dot blot, immunohistochemical staining, flow cytometry (FCM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Results Two hybridoma cell lines that secreted mAbs against PAR?1 were obtained. One mAb was IgM, and the other was IgG2b. Immunohistochemical staining revealed that the reactivities of mAbs to the lymphocyte cells in tonsil and colon tissues, to fibroblast cells in foreskin tissues, to macrophages in lung tissues were observed. FCM showed that the 2 mAbs reacted to PAR?1 expressed both on the membrane surface and in the cytoplasm of A549 cells. CLSM examination showed that the fluorescent markers were located both on the membrane and in the cytoplasm of A549 cells. Conclusion The mAbs against PAR?1 are prepared successfully, which provides a valuable tool for studies on inflammatory diseases.
KEY WORDS: proteinase activated receptor?1; monoclonal antibodies; enzyme linked immunosorbsent assay
蛋白酶活化受体?1(proteinase activated receptor?1, PAR?1)是一种蛋白质，由425个氨基酸组成，含7个疏水跨膜域，为典型的G蛋白偶联受体[1]。受体由细胞外区(N?末端和细胞外袢)、跨膜区(7个跨膜螺旋)及细胞内区(细胞内袢和C?末端)组成 。C?末端与受体脱敏和信号转导有关；N?末端有相应受体的蛋白酶裂解位点。在PA?l的N?末端，还有能够与凝血酶相互作用的水蛭素样序列。PAR?1广泛分布在各种组织细胞上，包括上皮细胞、血小板、内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞、T淋巴细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、 神经细胞、神经胶质细胞及某些癌细胞系等[2?3]。已知PAR?1对丝氨酸蛋白酶有高选择性应答作用，这些酶包括凝血酶、纤溶酶、凝血因子Xa、激活蛋白C。PAR?1结合并活化G蛋白触发级联反应，产生各种细胞效应：Ca2+外流、整联蛋白接合、细胞黏附迁移、基因表达、有丝分裂发生等[4]。另外，PAR?1在炎症反应中具有重要的调控作用，它可调节血小板增殖、血管舒张与收缩，增强血管通透性及粒细胞趋化作用 [5]。还有研究表明，PAR?1参与不同癌症的入侵和转移过程[4,6]。因此，我们制备抗PAR?1 mAb，为进一步研究PAR?1 在炎症及其他疾病中的作用提供重要的制剂。
1 材料与方法
1.1 实验动物 BALB/c小鼠，6-8周鼠龄，雄性，购自第一军医大学实验动物中心。
1.2 细胞株来源 小鼠骨髓瘤细胞P3/NS?1/1.Ag4.1(NS?1)引自European Collection of Cell Cultures；A549细胞系引自American Type Culture Collection。
1.3 主要试剂 免疫原PAR?1特异性片段(13肽：PESKATNATLDPR)购自Cl. Bio?Scientific Co. ud；福氏不完全佐剂和完全佐剂、过氧化物酶标记的羊抗小鼠免疫球蛋白及Ig类与亚类鉴定试剂均购自Sigma公司；DMEM、HAT购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；PEG MW4000购自Merck公司；化学发光试剂盒购自Pierce公司；PE标记的大鼠抗小鼠IgM及PE标记的大鼠抗小鼠IgG2b抗体购自Southern Biotech公司。
1.4 杂交瘤细胞的建立 免疫动物：将1g/L的PAR?1 0.50mL与等体积的福氏完全佐剂混合并充分乳化后，皮下多点注射3只BALB/c小鼠。间隔3周进行第2次免疫，改用福氏不完全佐剂，抗原量及注射途径不变。3周后进行第3次免疫，抗原量及注射途径不变。融合前3d，经尾静脉注射0.20mL的抗原生理盐水溶液加强免疫1次。细胞融合、杂交瘤细胞的筛选及克隆化，均按实验室常规进行。
1.5 mAb效价及Ig亚类的鉴定 ①效价测定：方法参照[1]。将杂交瘤细胞培养上清按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀释后用间接ELISA法测定A450值，以与靶抗原发生反应的mAb的最大稀释度即为其效价。②Ig亚类的鉴定：用capture ELISA法鉴定抗PAR?1mAb的Ig亚类。方法如下，分别用抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM 1∶1000稀释后取50μL包被检测板，室温放置3h；PBST冲洗3次后用30g/L BSA 100μL封闭4℃过夜；PBST冲洗3次加待测上清50μL，阳性对照分别加入鼠源50μL 1∶1000稀释的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM，阴性对照加50μL PBST，室温90min；PBST冲洗3次加poly anti?mouse Ig,室温60min；PBST冲洗3次显色。
1.6 mAb的特异性鉴定
1.6.1 Dot blot 每孔加100μL PBS，开空气阀抽40min；加抗原50μL(质量浓度1mg/L)，开空气阀抽1h；加30g/L BSA封闭，开空气阀抽1.5h；PBST洗3次，分别加待测上清50μL，阴性对照(标准培养液)50μL，开空气阀抽1h；PBST洗3次，再加过氧化物酶标记羊抗小鼠50μL(1∶500稀释)，开空气阀抽1h；PBST洗3次，显色并在成像系统照相。
1.6.2 免疫组化染色 将人肺、结肠、扁桃体及包皮组织依次进行固定、脱水、石蜡包埋及切片(片厚4μm)。染色当天将切片脱蜡，并经过1000-700mL/L乙醇、蒸馏水水化，滴加5mL/L H2O2及1g/L叠氮钠阻断内源性过氧化物酶，室温10min。PBS洗3次，滴加50g/L的牛血清白蛋白封闭非特异性蛋白质结合位点，室温10min。PBS洗3次，再依次滴加各株杂交瘤上清100μL(室温2h)及过氧化物酶标记羊抗小鼠Ig(室温40min)。DAB显色6min，苏木素复染15min，自来水冲洗15min。干燥后用Aquamount封片，观察结果。
1.6.3 流式细胞仪分析 用胰酶消化A549细胞，以4℃、500r/min离心5min，去上清，用PBS调细胞密度为1×109个/L，每个流式管中加入1mL细胞悬液，再以上述条件下离心。去上清，分透膜与未透膜两组进行。加入700mL/L的酒精固定细胞，冰上放置30min。透膜组PBS洗3次(加PBS 1mL，4℃、500r/min离心5min，弃上清，反复3次)，用2mL/L Triton X100透膜15min。然后两组均用PBS洗3次，依次加各株杂交瘤细胞培养上清200μL、同型对照抗体200μL(同型对照管相应加入1∶200小鼠IgM或IgG2b)，于4℃孵育1h。PBS洗3次，用200μL PBS重悬细胞，分别加入PE标记的大鼠抗小鼠IgM及IgG2b 3μL，于4℃避光孵育1h。PBS洗3次，用300μL PBS重悬细胞，在流式细胞仪上检测分析。
1.6.4 激光共聚焦分析 PBS洗涤Lab Tek多孔培养玻片上的A549细胞后，分透膜与未透膜两组进行。加入700mL/L的酒精固定细胞,冰上放置。30min后透膜组PBS洗3次用2mL/L Triton X100透膜15min，然后两组均PBS洗3次，依次加入各株杂交瘤细胞培养上清200μL，同型对照抗体200μL(同型对照管相应加入1∶200小鼠IgM、IgG2b)，4℃孵育1h。PBS洗涤3次，分别加入1∶1000稀释PE标记的大鼠抗小鼠IgM及IgG2b 200μL，4℃避光孵育1h。PBS洗涤3次，在激光共聚焦显微镜下观察结果。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 细胞融合后，经间接ELISA筛选和有限稀释法克隆化，共获得2株可稳定分泌抗PAR?1 mAb的杂交瘤细胞，分别命名为PAR1?1、PAR1?2。
2.2 mAb的效价及Ig亚类的鉴定 ①效价测定：经间接ELISA法测定，2株杂交瘤细胞PAR1?1、PAR1?2的培养上清中mAb的效价，分别为1∶64、1∶16。 ②Ig亚类鉴定：用capture ELISA法鉴定，PAR1?1为IgM，PAR1?2为IgG2b。
2.3 mAb的特异性鉴定 ①Dot blot分析表明，2株抗PAR?1 mAbs 均能与NC膜上的PAR?1抗原结合(图1)。②免疫组化染色显示，2株抗PAR?1 mAbs能将人扁桃体、结肠组织中的淋巴细胞，包皮组织中的成纤维细胞，肺组织中的巨噬细胞染成褐色(图2)。③流式细胞术表明，2株抗PAR?1 mAbs均能与A549细胞胞浆内及细胞膜上的PAR?1结合，细胞胞浆内PAR1?1 mAb，PAR1?2 mAb的平均荧光强度，分别为63.79、31.36；同型对照的平均荧光强度为5.18。细胞膜上PAR1?1 mAb，PAR1?2 mAb的平均荧光强度，分别为62.80、57.32；同型对照的平均荧光强度为6.00(图3)。④激光共聚焦扫描显微镜下观察，2株抗PAR?1 mAbs均能与A549细胞中的PAR?1结合，荧光标记阳性反应物在细胞胞浆内及细胞膜上均可见(图4)。
图1 mAb特异性的Dot blot鉴定（略）
Fig.1 Specificity of mAbs by Dot blot analysis
1: PAR1?1 mAb; 2: PAR1?2 mAb; 3: control
图2 mAb特异性的免疫组化染色鉴定（略）
Fig.2 Specificity of 2 mAbs by immunohistochemical staining (DAB ×400)
A: lymphocyte cell?like cells in the tonsil stained with PAR1?1 mAb; B: fibroblast cell?like cells in the foreskin stained with PAR1?2 mAb;C: lymphocyte cell?like cells in the colon stained with PAR1?2 mAb; D: macrophage cell?like cells in the lung stained with PAR1?2 mAb
图3 流式细胞仪分析mAb特异性(T?A、T?B为胞浆内表达，A、B为胞膜上表达)（略）
Fig.3 Specificity of 2 mAbs by FCM analysis (T?A and T?B were expressed in the cytoplasm, A and B were expressed on the membrane)
T?A, A: PAR1?1 mAb; T?B, B: PAR1?2 mAb
图4 mAb与A549细胞膜内、外反应的激光共聚焦显微镜观察(T?A、T?B为胞浆内表达，A、B为胞膜上表达)（略）
Fig.4 Observation of reactivities of 2 mAbs to cells within and on the membranes of A549 under CLSM (×400)
(T?A and T?B were expressed in the cytoplasm, A and B were expressed on the membrane surface); T?A, A: PAR1?1 mAb; T?B, B: PAR1?2 mAb
3 讨论
PAR?1最初在人血小板上被发现，首个被鉴定为蛋白酶活化受体，成为G蛋白偶联受体新家族的一员。PAR?1在不同组织中均有表达，未活化的PAR?1贮存在细胞膜和细胞内，形成了一个起保护作用的受体池[8]。PAR?1由丝氨酸蛋白酶—凝血酶剪切激活，产生许多细胞效应。首先，PAR?1在炎症反应中具有重要的调控作用，可调节血小板增殖、血管舒张与收缩，增强血管通透性及粒细胞趋化作用，其活化可延长和加重炎症反应；其次，PAR?1可以诱导成纤维细胞增殖，协助组织修复，还可以介导凝血酶诱发的成骨细胞增殖，在骨组织修复早期起作用[9]；再次，PAR?1可活化表皮生长因子受体，从而调控癌细胞的趋化性移行。最后，在神经系统中，凝血酶介导的PAR?1活化，还可诱导神经细胞、星形胶质细胞、肿瘤细胞系的凋亡。因此，制备抗PAR?1 mAb，可为炎症及其他疾病的研究提供重要的制剂。
在研究中，我们运用杂交瘤技术成功地制备出2株可稳定分泌抗PAR?1 mAbs的杂交瘤细胞。间接ELISA测定PAR1?1 mAb﹑PAR1?2 mAb的效价分别为1∶64和1∶16，其Ig亚类分别为IgM和IgG2b；Dot blot分析表明，2株mAbs均能与PVDF膜上的PAR?1抗原起反应；免疫组化染色显示，抗PAR?1 mAb能与扁桃体和结肠组织中的淋巴细胞，包皮组织中的成纤维细胞，肺组织中的疑似巨噬细胞结合；FCM和CLSM分析表明，2株mAbs均能与A549细胞胞浆内及细胞膜上的PAR?1结合，呈现不同程度的阳性反应。以上几项鉴定表明，2株抗PAR?1 的mAbs具有较高的特异性。目前，国内尚无商品化的PAR?1 mAb出售，因此，PAR?1 mAb的成功研制为进一步的研究提供了有用的试剂。
基金项目：国家基金资助项目(No.30471601)；广东省科技计划重点项目(No.2003B31502)；广东省自然科学基金重点项目(No.04106122)；李嘉诚先生捐资款专项经费(No.C0200001)
【】
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