丹参乙酸镁活性代谢产物在大鼠体内的药代动力学特征

                    作者：王王乐，陆优丽 ，杨鼎，薛智谋，王逸平 

【摘要】  目的 研究丹参乙酸镁代谢产物M1(3′?O?monomethyl?lithospermic acid B)和M2(3′, 3′′?O?dimethyl?lithospermic acid B)在大鼠体内的药代动力学特征。方法 大鼠静脉注射丹参乙酸镁代谢产物M1或M2，液质联用法进行MRM扫描分析，测定代谢物M1和M2血药浓度，药代动力学参数。结果 采用该液质联用色谱测定血浆样品中丹参乙酸镁代谢物的方法，血浆内源性物质均不干扰样品峰，相对回收率为：87%-101.4%，日间和日内相对变异系数(CV%)均小于9.77%，血浆中的最低定量限为1μg/L(S/N≥3)，线性范围为16-4096μg/L。M1和M2的t1/2z分别为(1.54±0.81)h和(1.52±0.42)h，MRT(0-t)分别为(0.46±0.07)h和(0.33±0.05)h，AUC(0-tn) 分别为(13.63±2.7)(mg·h)/L和(14.96±2.54)(mg·h)/L。结论 M1和M2静脉注射的体内代谢过程符合二室模型，消除较快。

【关键词】  丹参乙酸镁；代谢物；液质联用；大鼠；药物代谢动力学

　　Pharmacokinetic characteristics of the active metabolites of　magnesium lithospermate B in rats

　　ABSTRACT: Objective  To study the pharmacokinetics of two main metabolites of magnesium lithospermate B, 3′?O?monomethyl?lithospermic acid B and 3′, 3′′?O?dimethyl?lithospermic acid B, in Sprague?Dawley rats. Methods  Serum was collected from rats at various times after animals were intravenously administered with M1 or M2, respectively. The analysis of M1 and M2 was performed in the MRM model by liquid chromatography/tandem mass spectrometry method and their pharmacokinetic parameters were calculated. Results  In this method, the determination was not distracted by endogenous factors. Recovery of M1 and M2 was 87%-101.4%, intra? and inter?assay CVs were lower than 9.77%，LOQ was 1μg/L(S/N≥3). Calibrations between 16-4096μg/L exhibited consistent linearity and reproducibility. The main parameters of pharmacokinetics of M1 and M2 were as follows: t1/2z of M1 and M2 was (1.54±0.81)h and (1.52±0.42)h, MRT(0-t) of M1 and M2 was (0.46±0.07)h and (0.33±0.05)h, AUC(0-tn) of M1 and M2 was (13.63±2.7)(mg·h)/L and (14.96±2.54) (mg·h)/L, respectively. Conclusion  The pharmacokinetic characteristics of M1 and M2 by intravenous administration in rats is described by a two?compartment model. M1 and M2 were rapidly eliminated.

　　KEY WORDS: lithospermic acid B; metabolite; liquid chromatography/mass spectrometry; rat; pharmacokinetics

　　丹参乙酸镁(magnesium lithospermate B, MLB)为传统中药丹参中最重要的水溶性有效活性物质[1?2]，具有抗氧化、清除自由基[3?4]、保护心、肝、肾功能损伤的作用，并影响血栓形成和ATP酶活性[5?8]。M1(3′?O?monomethyl?lithospermic acid B)和M2(3′, 3′′?O?dimethyl? lithospermmic acid B)为丹参乙酸镁的两种主要代谢产物，亦具有抗氧化的作用[9]。在本研究中我们通过对M1和M2在体内的药代动力学研究，以期为丹参有效成分的临床应用提供实验依据。

　　1  材料与方法
　　
　　1.1  仪器  API3000串联质谱仪(美国应用生物系统公司生产)；日本岛津高效液相色谱仪，包括2台LC?10AD泵、在线脱气机及SIL?HTC自动进样器；XW?80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂生产)；80?2B台式离心机(上海安亭仪器厂生产)；气体吹干装置(江苏太仓医用器械厂生产)；自动双重纯水蒸馏器(上海玻璃仪器公司和上海申科机械研究所生产)。

　　1.2  药品与试剂  丹参乙酸镁代谢产物对照品M1含量92.9%，M2含量90.4%，内标物水飞蓟素含量≥98%，均由科学院上海药物所植物化学研究室提供(图1)。乙腈(Fisher试剂公司，色谱纯)；甲酸、丙酮、乙酸乙酯(Sigma公司，分析纯)；水(自制重蒸水)。

　　图1  M1、M2和IS的结构图（略）

　　Fig.1 Chemical structure of M1, M2 and Silibinin (IS)

　　1.3  实验动物  雄性SD大鼠，体重约250g，由中科院上海实验动物中心提供(许可证号：No.SCXK 2003?0003)。实验前大鼠禁食12h。

　　1.4  实验方案  SD大鼠12只，平均分为2组，分别股静脉注射M1和M2 20mg/kg，静注给药时间为20s，给药前及给药后0.033、0.133、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、8h从尾静脉采血进行药代动力学研究。 血样采集后均4℃放置2h后4000g×10min离心得血清样品，置-80℃冷冻保存待测。临用前按样品预处理方法处理后进样测定血药浓度。

　　1.5  血清中代谢物M1和M2含量测定

　　1.5.1  贮备液  精密称取M1、M2和水飞蓟素适量，用甲醇分别配制成质量浓度为1g/L的贮备液。置于4℃冰箱内保存。

　　1.5.2  血样预处理  取血清100μL置2mL具塞塑料离心管中，加入内标液(2mg/L)10μL ，旋涡混合10s后加入200μL丙酮?甲酸?水(70∶2∶28，V∶V∶V)，旋涡混合10s，再加入1mL乙酸乙酯提取，自动旋涡混合2500g×5min，16000g ×3min高速离心分层，吸取上层有机相，置35℃恒温气体吹干装置中吹干。用100μL丙酮?水(1∶3，V∶V)重组，将重组液高速离心16000g×3min，取上清液进样分析。

　　1.5.3  质谱条件  电喷雾离子源，负离子扫描；喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：12L/min；气帘气流速：10L/min；碰撞气流速：12L/min；离子源电压：-4500V；离子源温度：450℃；MRM扫描分析，离子选择通道分别为731/533(M1)、745/547(M2)、481/301(水飞蓟素)。其他仪器参数见表1，二级质谱图见图2。

　　表1  API3000仪器参数（略）

　　Table 1  Parameters of API3000

　　DP: declustering potential; FP: focusing potential; EP: entrance potential; CE: collision energy; CXP: collision cell exit potential

　　图2  M1、M2和IS的MS2图（略）

　　Fig.2 MS2 mass spectra of M1, M2 and Silibinin (IS)

　　1.5.4  液相条件  分析柱为CAPCELL PAK C18 (50×2mm，5μm)；流动相A：0.13mol/L甲酸水溶液；流动相B：乙腈。A∶B=60∶40，流速为0.25mL/min，进样体积10μL。M1和M2的保留时间分别为1.34、1.55min，水飞蓟素的保留时间为1.74min。色谱图见图3。

　　图3  M1、M2、IS的LC?MS/MS色谱图（略）

　　Fig.3 LC?MS/MS chromatogram of M1, M2 and Silibinin (IS) in rat serum

　　Peak A, B and C refer to M1, M2 and IS, respectively. a: blank serum sample; b: serum sample spiked with M1, M2 and IS, respectively

　　1.6  统计学处理  测得SD大鼠不同时间的血药浓度之后，药代动力学参数用DAS2.0程序处理，实验数据以±s表示。运用SPSS软件统计数据，采用ANOVA进行药代动力学参数的统计分析。

　　2  结果

　　2.1  方法学确证

　　2.1.1  线性范围和检测灵敏度  在血浆中加入不同量的丹参乙酸镁代谢物M1和M2贮备液，配制成质量浓度分别为16、32、128、256、512、1024、2048和4096μg/L的血浆标准液，按生物样本预处理方法处理后进样。以添加浓度为X轴，代谢物与内标物的峰面积比为Y轴，进行线性回归，经“1/X”权重得回归方程分别为： M1：y=0.00659x-0.115，r=0.9987； M2：y=0.00709x-0.102 ，r=0.9993。结果表明，代谢物M1和M2在16-4096μg/L范围内线性关系良好，血浆中最低定量限为1μg/L(S/N≥3)。

　　2.1.2  精密度与回收率  在血浆中加入不同量的标准液，按生物样本预处理方法处理后，分别测定批内、批间精密度，回收率。结果表明，本方法批内CV<8.36%，批间CV<9.77%，回收率87.0%-101.4%(表2)。

　　2.1.3  稳定性  在空白血清中加入不同量的M1和M2标准贮备液后，置-20℃冰冻保存。分别于0、24、48h时取出，室温解冻，即按生物样本预处理方法处理后测定，考察方法稳定性，结果见表3。

　　表2  M1和M2的精密度和回收率（略）

　　Table 2  Precision and recovery of M1 and M2

　　表3  M1和M2 的稳定性（略）

　　Table 3  Stability of M1 and M2

　　2.2  血药浓度结果  SD大鼠股静脉注射丹参乙酸镁代谢物M1或M2 20mg/kg后各时间点所测得的血药浓度?时间曲线分别见图4。
　　
　　图4  M1和M2股静脉注射给药后血药浓度?时间曲线（略）

　　Fig.4 Serum concentration?time curve of M1 and M2 in rats after iv. adminstration (n=6)

　　2.3  药代动力学数据  SD大鼠血药浓度?时间曲线经计算后获得的药代动力学参数如表4所示，M1和M2的MRT(0-t)的差值为0.12h，AUC(0-tn) 分别为(13.63±2.7)(mg·h)/L和(14.96±2.54)(mg·h)/L。

　　表4  SD大鼠股静脉注射M1和M2 20mg/kg后的主要药代动力学参数（略）

　　Table 4  The main pharmacokinetic parameters of M1 and M2 after iv. dose of 20mg/kg in SD rats

　　3  讨论
   
　　本实验采用了液相色谱质谱联用的技术，对血液中丹参乙酸镁代谢物M1和M2进行了测定。该方法操作简便、特异性强、灵敏度高、取血量少，符合生物样品的分析要求，每个样品控制在3min左右，这为大批样品的测定和实验结果的可靠性提供了现实基础。    SD大鼠静脉注射给药M1和M2(20mg/kg)后，两者在大鼠体内代谢情况相似，其表观分布容积(Vz)分别为3.22、3.01L/kg，说明药物在体内分布广泛，或在某些组织蓄积。M1和M2代谢较快，消除半衰期都约为1.5h，略长于丹参乙酸镁。
   
　　本实验曾用乙睛作为蛋白沉淀剂，结果发现提取回收率低，且内标水飞蓟素不稳定，在2h内下降大于10%，而改用丙酮∶水∶甲酸 (70∶28∶2, V∶V∶V)作蛋白沉淀剂，提取回收率较高，内标稳定。

【】
  　　[1]Kasimu R, Tanaka K, Tezuka Y,et al.Comparative study of seventeen Salvia plants: aldose reductase inhibitory activity of water and MeOH extracts and liquid chromatography?mass spectrometry (LC?MS) analysis of water extracts [J]. Chem Pharm Bull, 1998, 46(3):500?504.

　　[2]周长新, 丹羽正武. 丹参中水溶性成分的研究 [J]. 药科大学学报, 1999, 30: 411?416.

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　　[4]Yokozawa T, Chung HY, Dong E, et al. Confirmation that magnesium lithospermate B has a hydroxyl radical?scavenging action [J]. Exp Toxicol Pathol, 1995, 47(5):341?344.

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　　[9]Zhang Y, Akao T, Nakamura N,et al. Megnesium lithospermate B is excreted rapidly into rat bile mostly as methylated metabolites, which are potent antioxidants [J]. Drug Metab Dispos, 2004, 32(7):752?757.