单纯疱疹病毒2型gG?2“独特区”基因的原核表达及其血清学诊断价值

                 作者：孙乐栋，曾抗，王茜，周再高，刘凤岩

【摘要】  目的 在大肠杆菌中表达HSV?2的gG?2“独特区”基因(gG?2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法 克隆HSV?2的gG?2T，并在大肠杆菌中表达gG?2T融合蛋白。通过Western blot和间接ELISA鉴定融合蛋白的活性。结果 通过原核系统表达的gG?2T融合蛋白可以与GST多克隆抗体结合并在46ku附近出现特异性结合条带。并且能够与确诊的HSV?2患者血清反应，而不与HSV?1患者血清和正常人血清反应。结论 获得了HSV?2 gG?2T融合蛋白，它可以与GST多克隆抗体特异性结合并且可以同HSV?2型患者血清特异性反应；获得的gG?2T蛋白为研究以gG?2蛋白作为靶区域的诊断试剂盒和疫苗研发打下实验基础。

【关键词】  单纯疱疹病毒；糖蛋白G?2；独特区基因；融合蛋白；表达

　　Expression in prokaryotic system and serodiagnostic value of herpes　simplex virus type 2 glycoprotein G?2 unique domain

　　ABSTRACT: Objective  To express the unique gene of herpes simplex virus type 2 (HSV?2) gG?2 (gG?2T) in E.coli BL21, and study preliminarily the lemologic characteristics of gG?2T protein. Methods  We cloned the gene of gG?2T and had gG?2T fusion protein expressed in E.coli BL21, and identified its activity by Western blot and indirect ELISA. Results  Glycoprotein G?2T fusion protein could combine with GST polyclonal antibody through gG?2T fusion protein expressed in prokaryotic system and SDS?PAGE had a specific binding strap in 46ku nearby. The gG?2T fusion protein could react with HSV?2 patients? serum, but not with HSV?1 patients? serum and r?Globulin. Conclusion  We obtained gG?2T fusion protein, which can combine with GST polyclonal antibody and react with HSV?2 patients? serum specifically. It will provide an experimental basis for diagnostic kit and vaccine of gG?2 protein target area.

　　KEY WORDS: herpes simplex virus; gG?2; unique gene; fusion protein; expression

　　单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)属于α疱疹病毒亚科，是引起人类病毒性疾病中常见的病毒之一。根据抗原性的差别可将其分为HSV?1和HSV?2两种血清型。HSV?2型主要与外生殖器感染和新生儿感染有关，可引起生殖器疱疹、新生儿疱疹。并认为可能与生殖器恶性肿瘤相关，同时增加了AIDS的感染机会[1]。HSV?2病毒颗粒中有至少12种胞膜糖蛋白，其中gG?2为型特异性抗原[2]。gG?2在单纯疱疹2型病毒诊断、分型、疫苗研究中具有举足轻重的作用。HSV?2的gG?2存在于一段与HSV?1的gG?1基因高度同源的序列以及一段基因独特的保守区段。通过信息学软件预测发现具有强抗原表位的gG?2基因独特区位于285-482aa之间的gG?2基因[3]。gG?2基因的独特区段对于病毒的诊断和分型有着非常重要的意义。本研究对HSV?2的gG?2“独特区”(unique gene of HSV?2 gG?2, gG?2T)基因进行克隆、表达、纯化并对其抗原活性进行初步验证，为以gG?2蛋白作为靶区域的型特异性诊断试剂和疫苗研发打下实验基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  病毒株  HSV?2病毒株由本课题组在性病门诊单纯疱疹病毒感染患者水疱中分离培养，经gG?2基因扩增、重组克隆的筛选与鉴定、重组基因组测序及序列分析，证实为HSV?2病毒并保存于Vero细胞[3]。DH5α、BL21细胞由本实验室保存。重组HSV?2/gG?2T载体质粒由本实验室保存。

　　1.2  主要试剂  DNA纯化试剂盒购于申能博彩公司，ExTaq酶、dNTP购于TaKaRa公司，pGEX?4T?1载体是本实验室保存的。GST标签融合蛋白纯化试剂盒购于北京正旦公司。

　　1.3  引物设计  根据GenBank提供的HSV?2病毒(Z86009)基因组全序列，利用Lasergene?PrimerSelect软件设计引物。上游的引物序列是“5′?GAATTCATGGCACGACCCACGGAAGACG?3′”；下游的引物序列是5′?CTCGAGCGGGGTTGCGGGTCCGG?3′(由上海博亚生物技术有限公司合成)。

　　1.4  PCR反应  使用TaKaRa公司ExTaq酶进行PCR反应。反应液包括：2.5mmol/L的dNTPs 3μL、10×PCR buffer 3μL、上游引物1μL、下游引物1μL、ExTaq 0.5μL、cDNA模板5μL、水16.5μL，总体积30μL。反应条件：94℃ 2min，94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 8min，4℃保存。

　　1.5  基因克隆  使用申能博采公司DNA纯化试剂盒回收PCR产物，将回收产物与pGEM?T载体连接， 4℃放置 12h。将重组载体转化为DH5α感受态细胞，于氨苄青霉素抗性固体LB培养基上37℃培养16h，利用X?Gal和IPTG筛选阳性重组克隆。

　　1.6  HVS?2?gG?2T基因表达载体的构建  将鉴定阳性的克隆扩大培养，提取质粒并用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切重组质粒，获取gG?2T片段，与同样经过EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切的表达载体pGEX?4T?1连接，转化DH5α感受态细胞。对阳性克隆扩大培养并提取质粒，转化BL21感受态细胞。提取转化菌质粒进行EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，将转化菌送TaKaRa公司测序。

　　1.7  gG?2T基因在BL21中的表达与纯化  重组表达质粒pGEX?4T?1?gG?2T转化BL21后，优化表达条件，将阳性克隆在37℃条件下含氨苄青霉素的LB培养基中培养至A600值为0.5-0.6时，加入异丙基?β?D?硫代半乳糖苷(isopropylthio?β?D?galactosid, IPTG)至终浓度0.2mmol/L，28℃条件下诱导2h。用聚丙稀酰胺凝胶电泳和Western?Blot免疫印迹分析表达产物。表达蛋白纯化按北京正旦公司谷胱氨肽S?转移酶(glutathione S transferase, GST)标签融合蛋白纯化试剂盒说明进行操作。

　　1.8  免疫印迹  将SDS?PAGE凝胶转印硝酸纤维素膜，封闭后加入GST多克隆抗体，孵育洗涤后按常规加入羊抗兔酶标二抗与底物进行显色反应。

　　1.9  酶联免疫吸附试验  用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(包被液)稀释纯化蛋白至终质量浓度0.2g/L，微空板每孔加入200μL，4℃过夜。弃去包被液，每孔加入封闭液(100g/L BSA)200μL，37℃封闭1h，用PBST洗涤5次，拍干。每孔加入1∶100稀释的待测血清100μL，37℃孵育2h，用PBST洗涤5次，拍干。每孔加入1∶1000稀释羊抗人IgG抗体100μL，37℃孵育2h PBST洗涤5次，拍干。加邻苯二胺(O?phenydiamino, OPD)和H2O2显色10min，加入50μL终止液终止反应，立刻于490nm条件下测A值。

　　2  结果

　　2.1  HVS?2?gG?2T基因的扩增  所获目的片段大小为591bp。测序结果表明插入片段序列与GenBank中HSV2?333株对应部分核酸同源性为99.8%。

　　2.2  重组表达载体的鉴定  提取阳性转化质粒进行PCR及EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，0.07g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR可扩增出591bp的片段，双酶切结果显示4900bp和591bp的片段(图1)。

　　图1  PCR鉴定及双酶切重组质粒载体pGEX?4T?1?gG?2T（略）

　　Fig.1 Identification of recombinant pGEX?4T?1?gG?2T by double digestion

　　M: DNA marker DL15000; 1: pGEX?4T?1?gG?2T plasmid digested by EcoRⅠ/XhoⅠ; 2: identification of recombinant pGEX?4T?1?gG?2T by PCR

　　2.3  目的片段在E.coli BL21中的表达  用100g/L SDS?PAGE电泳检测表达产物，对HVS?2?gG?2T/BL21诱导前和诱导后进行比较，发现HVS?2?gG?2T/BL21诱导后在46ku左右有一条明显的新生蛋白条带，与预计大小的融合蛋白的大小相符，凝胶扫描分析显示融合蛋白占菌体蛋白的60%左右。通过超声裂解后，融合蛋白可溶性表达在上清中含量占上清蛋白的40%左右。Western?Blot免疫印迹分析表明，表达产物能与GST多克隆抗体特异性结合，在硝酸纤维素膜上形成一条特异性条带(图2)。

　　图2  pGEX?4T?1? gG?2T的表达情况及Western?Blot免疫印迹的结果（略）

　　Fig.2 The expression of pGEX?4T?1?gG?2T and Western?blot analysis

　　M: the low molecular protein marker; 1: the lysate of pGEX?4T?1?gG?2T; 2: the lysate of pGEX?4T?1?gG?2T induced IPTG; 3: W?B for pGEX?4T?1?gG?2T fusion protein

　　2.4  表达产物的纯化  HVS?2? gG?2T/BL21诱导后超声破菌，表达产物在上清和沉淀中均含有目的蛋白。在目的蛋白中加入5μmoL/L DTT后使用GST亲和纯化树脂纯化目的蛋白。再用50mmoL/L还原性谷光苷肽洗脱纯化蛋白，纯化浓度达到95%以上(图3)。

　　图3  目的蛋白的纯化结果（略）

　　Fig.3 The purification result of interest protein

　　M: the low molecular protein marker; 1: the purified target protein pGEX?4T?1?gG?2T washed

　　2.5  检测纯化蛋白的抗原活性和特异性  免疫印迹结果显示，Mt约46ku的蛋白质可与GST多克隆抗体特异性结合。用纯化的gG?2T蛋白包被，与10例确诊为HSV?2型患者阳性血清和10例正常人血清进行间接ELISA反应(图4)。结果显示纯化的gG?2T蛋白能与HSV?2型阳性血清发生反应而不与正常人血清发生反应。用纯化蛋白gG?2T包被，与10例确诊为HSV?2型患者血清和10例确诊为HSV?1型的患者血清进行间接ELISA反应(图5)。结果显示gG?2T能与HSV?2型患者的血清反应，而不与HSV?1型患者的血清反应。

　　图4  表达蛋白gG?2T抗原活性的鉴定结果（略）

　　Fig.4 The identification of antigen activity of the gG?2T

　　图5  表达蛋白gG?2T的特异性鉴定结果（略）

　　Fig.5 The identification of specificity of gG?2T

　　3  讨论
   
　　HSV?2包膜糖蛋白gG?2由US4基因编码的699个密码子组成，包括一个与HSV?1 gG?1基因高度同源的区域和一个“独特区”[4]。通过对gG?1蛋白和gG?2蛋白的对比以及B细胞抗原表位的预测，我们发现gG?1基因和gG?2基因在“独特区”中的同源性非常低。Grabowsk等[5]利用噬菌体展示技术发现两个位于gG?2“独特区”内的免疫显位在氨基酸残基的351?427、525?587内，并通过试验证明这两段氨基酸残基只与HSV?2型单纯疱疹病毒反应而不与HSV?1型单纯疱疹病毒反应。Ikoma等[6]利用杆状病毒表达系统表达gG?2(281aa-594aa)，检测HSV?2型感染患者血清特异性抗体，特异性和敏感性达到95.5%。由此说明这两段区域的肽段适合用作临床抗体检测，尤其适合用作HSV?2分型诊断。
   
　　研究发现HSV?2的gG?2基因序列抗原区域极少突变，即使出现了点突变也不会消弱gG?2的血清学活性[7]。该报告进一步证实gG?2基因可以作为型特异性抗原，同时指出gG?2基因的保守性是作为HSV?2特异疫苗成分的先决条件。
   
　　本实验成功构建出HSV?2型gG?2“独特区”(285aa?482aa)基因片段，利用原核表达载体表达出含有gG?2“独特区”的融合蛋白，通过Western?blot免疫印迹检测的表达蛋白能与GST多克隆抗体特异性结合。纯化的蛋白为我们需要的目的蛋白。间接ELISA证明纯化的蛋白能够与HSV?2阳性患者反应而不与正常人血清和HSV?1型患者的血清反应。表明原核表达的蛋白具有一定的免疫学活性。以上研究为单纯疱疹病毒2型感染的型特异性诊断试剂的研发、生殖器疱疹病毒的筛查、型特异性疫苗研究寻找更好的靶位点提供了。

【参考】
  　　[1]孙乐栋,周再高,曾抗,等. 性乱人群中单纯疱疹2型病毒感染情况及丽珠威的疗效观察 [J]. 第一军医大学学报, 2001, 21(10):769.

　　[2]周建勋. 单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV?2)包膜糖蛋白G?2相关研究进展 [J]. 国外医学病毒学分册, 2004, 11(4):123?126.

　　[3]王茜，曾抗，孙乐栋，等. 单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的基因扩增、克隆及其B细胞抗原表位分析 [J]. 第四军医大学学报, 2006, 27(13):1217?1219.

　　[4]Gorander S, Svennerholm B, Liljeqvist JA. Secreted portion of glycoprotein g of herpes simplex virus type 2 is a novel antigen for type?discriminating serology [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41 (8):3681?3686.

　　[5]Grabowska A, Jameson C, Laing P, et al. Identification of type specific domains within glycoprotein G of herpes simplex virus type 2(HSV?2) recognized by the majority of patients infected with HSV?2, but not by those infected with HSV?1 [J]. Gen Virol, 1999,80(7):1789?1798.

　　[6]Ikoma M, Liljeqvist JA, Groen J, et al. Use of a fragment of glycoprotein G?2 produced in the baculovirus expression system for detecting herpes simplex virus type 2?specific antibodies [J]. Clin Microbiol, 2002, 40(7):2526?2532.

　　[7]Liljeqvist JA, Syennerholm B,Bergstrom T. Conservation of type?specific B?cell epitopes of glycoprotein G in clinical herpes simplex virus type 2 isolates [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(12):4517?4522.