血管活性肠肽对暂时性脑缺血大鼠梗死体积的影响
【摘要】 目的 通过活体实验研究血管活性肠肽(VIP)对脑缺血损伤的神经保护作用。方法 大鼠侧脑室内注射VIP后，采用大脑中动脉线栓(MCAO)法诱导建立暂时性局部脑缺血模型。通过神经学的评价对MCAO大鼠进行判定和筛选；TTC染色测定大鼠脑梗死体积；双抗夹心ELISA检测血清S100β的含量。结果 MCAO后2h大鼠呈现不同程度的神经功能损伤症状。评定为1-2级的仅有2例出现明显脑梗死区，3级的为全部。VIP注射后大鼠脑梗死体积明显缩小，较对照组减少约25%(P<0.05)；血清S100β浓度也明显降低(P<0.05)。结论 以神经学评分3级作为MCAO模型成功的判定标准是较为可靠的。VIP脑内注射可明显减小脑缺血后梗死体积，具有神经保护作用。VIP可以降低S100β的含量，这可能涉及到VIP的另一神经保护机制。
【关键词】 血管活性肠肽；脑缺血；梗死体积；S100β
Effects of vasoactive intestinal peptide on the infarct volume in rat transient focal cerebral Ischemia
ABSTRACT: Objective To explore the neuroprotective effects of vasoactive intestinal peptide (VIP) on ischemic brain injury in vivo. Methods In the present study, VIP was given via intracerebroventriclar injection, and then focal cerebral ischemia was induced in SD rats by intraluminal occlusion of middle cerebral artery (MACO) for 120min. The evaluation and screening of rats with successful occlusion of MCA were performed by neurological testing. The infarct volume was investigated with 2, 3, 5?triphenyltetrazolium chloride (TTC) stain. S100β concentration in serum was detected by double?antibodies?sandwich?ELISA method. Results The different grades of neurological severity appeared obviously in all the rats at 2 hours after MCAO. Only two rats that scored grade 1 or 2 had identifiable areas of infarction, whereas the areas of infarction in all the rats that were scored grade 3 were identified. Compared to the control groups at 1 day, injection of VIP significantly reduced the relative infarct volume by approximately 25% (P<0.05), and then remarkably decreased S100β serum concentration (P<0.05). Conclusion The grade 3 of neurological score as a standard to evaluate successful occlusion of MCA is satisfactory and reliable. VIP injection can reduce the infarct volume in a rat model of focal cerebral ischemia. The present study provides further evidence for the neuroprotective effects of VIP in vivo. VIP may decrease S100β serum concentration, which may involve one of the mechanisms of the neuroprotective effect of VIP.
KEY WORDS: vasoactive intestinal peptide; cerebral ischemia; infarct volume; S100β
缺血性脑血管病具有高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的特点，是中老年人常见的脑血管疾病，引起国内外医学界特别是神经界的重视。急性的脑缺血损伤是非常复杂的病理生理过程，许多环节尚未阐明。目前，用于脑保护的药物很多，但是有确切疗效的却寥寥无几。进一步深入了解脑缺血的机制，探究更为有效的治疗方法和药物已经成为医学界面临的重要问题。血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)由28个氨基酸残基组成。它与组异肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽、生长激素释放激素及促胰液素的结构相似，属于促胰液素?胰高血糖素?血管活性肠肽家族的成员。体外实验显示VIP能提高培养的星形胶质细胞(astrocyte, AS)摄取谷氨酸的能力，促进胶质源性营养物质的释放，参与保护神经元[1]。提示VIP在脑缺血损伤中可能具有神经保护作用，但缺乏足够的活体实验证据，具体作用及机制有待深入研究。因此，本实验通过活体研究观察脑内注射VIP后对暂时性局部脑缺血大鼠缺血体积和血清S100β浓度变化的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性Sprague?Dawley(SD)大鼠由西安大学医学院实验动物中心提供，鼠龄8-12周，体重240-280g。实验前常规环境分笼饲养至少3d。
1.2 药物实施 大鼠经水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪，参照包新民等的《大鼠立体定位图谱》，选择右侧脑室[以前囟(Bregma点)为0点，向后1.0mm，旁开1.4mm，深3.5mm]为注射区，VIP组大鼠注射VIP(0.25g/L)溶液2μL，留针10min，缝合皮肤。对照组大鼠用等容量生理盐水作同样处理。然后制作成暂时性局部脑缺血模型。
1.3 暂时性局部脑缺血模型的建立 VIP脑内注射后即刻longa等[2]描述的管腔内线栓技术闭塞右侧大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion, MCAO)诱导建立暂时性局部脑缺血大鼠模型。简要手术过程：大鼠做颈部前正中切口，分离暴露右侧颈部血管，用微动脉夹暂时夹闭颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉。将头端加热呈光滑椭圆球形的3?0单股尼龙线(宁波医用缝针厂)经颈外动脉缓慢插入颈内动脉至感到有轻微阻力为止，进线长约18mm左右。手术期间使用电热毯维持大鼠体温在36.5-37.5℃之间。MCAO后2h轻轻抽出尼龙线至颈外动脉结扎处。
1.4 神经学的评价 大鼠MCAO后2h参照Bederson等[3]方法进行神经功能损伤程度的评定，即0级：行为正常；1级：提尾悬空左侧前肢屈曲，肩内收；2级：抵抗对侧推力下降，伴前肢屈曲；3级：自发性侧向旋转或运动，伴抵抗对侧推力下降和前肢屈曲。评定为3级者被视为成功脑缺血模型。
1.5 血清标本制备 动物于处死前，经右心室取血1.5×10-3L，3000r/min离心10min，吸取上清液，-20℃冻存。
1.6 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 VIP组(n=5)和对照组(n=5)大鼠于MCAO后24h处死，断头迅速取脑，置于-20℃冷冻10min后，在脑片床上自前向后行2mm厚连续冠状切片，将切片立即置于预热的20g/L TTC(国药集团化学试剂有限公司的产品)溶液中，于37℃恒温下避光染色30min，随后置于40g/L多聚甲醛溶液中固定24h，照像。
1.7 梗死体积测定 将TTC染色照片扫描并存储，使用Motic Images Advanced 3.0图像分析系统测定梗死体积。为消除水肿的影响，梗死体积以占缺血侧半球体积的百分比表示。即：梗死体积(%)＝(直接梗死体积÷同侧半球体积)×100%。
1.8 血清S100β含量的测定 采用双抗夹心ELISA检测血清S100β含量。按照S?100β ELISA试剂盒(由第四军医大学生教研室提供)说明进行。小鼠抗大鼠S?100β单克隆和兔抗S?100多克隆抗体均由武汉Boster公司提供。
1.9 统计学分析 所有数据均以均数±标准差表示，并定义P<0.05为显著性界值。样本之间的显著性采用t检验方法处理。
2 结果
2.1 神经学的评价 各组大鼠的体重、体温没有明显不同。MCAO后30min内每只大鼠的体温都有所增高，但此后便逐渐下降(恢复)到正常范围。所有动物苏醒后均出现右侧上眼睑下垂等Horner征。MCAO后2h神经功能损伤程度的评定显示共有7只大鼠为1或2级，10只为3级，各组间没有明显差异。24h后经TTC染色证实，评分为1-2级的大鼠仅有2只出现明显脑梗死区，而评分为3级的大鼠均出现明显脑梗死区(表1)。
表1 MCAO后2h神经学评价与脑梗死的关系（略）
Table 1 The relationship between neurological scores and cerebral infarction 2h after MCAO
2.2 TTC染色和脑梗死体积的变化 MCAO再灌注后第1天，VIP组和对照组大鼠的脑梗死体积分别为(15.72±3.52)%和(21.01±2.64)%(图1)。VIP组较对照组减少约25%，差异有显著性(P<0.05)。从具有代表性的6个TTC染色脑片(图2)可以清楚看出上述的影响。在对照组未梗塞侧半球正常脑组织呈现鲜红色，而在栓塞侧半球大脑中动脉供血区出现大面积明显的未被染色的白色缺血梗死区，主要位于尾壳核的外侧部和周围的额顶叶和颞叶上外侧皮质。受影响最明显的脑片是中部的2-4脑片(约在前囟前和后3mm之间的部位)。这是大脑中动脉的最主要供血区。与对照组相比，VIP组大鼠尾壳核以及周围皮质的大部区域未受影响，梗死区明显减小。
2.3 血清S100β含量的变化 正常大鼠血清S100β含量极低，本实验未能检测出。MCAO再灌注后1d，VIP组大鼠血清S100β含量较对照组明显降低(图3)。对照组ELISA检测值为(8.43±0.82)μg/L，VIP组为(6.28±0.49)μg/L，两组之间有显著性差异(P<0.05)。
图1 缺血纹状体和皮质的梗死体积（略）
Fig.1 The infarct volume in the ischemic striatum and cortex
*P<0.05 vs. control group
图2 MCAO后1d，VIP组(左侧)和对照组(右侧)TTC染色脑冠状切片（略）
Fig.2 Representative coronal brain sections stained with TTC from the control (right side) and VIP group (left side) at day 1
The infarct volume of VIP group significantly reduced compared to that of control group
图3 血清S100β含量的比较（略）
Fig.3 Comparison of S100β concentrations in serum
*P<0.05 vs. control group
3 讨论
建立一个可重复的、稳定可靠的动物模型，是研究脑缺血神经保护作用及其机制所必需的。1986年Koizumi首次采用不开颅经颈总动脉栓入尼龙线致大脑中动脉闭塞获得成功。该模型具有不需开颅、手术时间短、可准确控制缺血再灌注时间等优点。目前，已被广泛用于实验性脑缺血研究。但是，由于该模型手术操作是在非直视下进行的，许多因素如动物的品系、体重和栓线的粗细等对MCA的闭塞结果均有明显的影响。因此，造成MCAO成功率较低。目前，一般通过对术后神经功能缺陷进行评分来评价模型缺血效果，并以此进行初步的筛选。本实验在对大鼠种系、体重和体温严格控制下，采用Bederson等[3]神经功能缺陷评分作为模型成功标准的判定，结果显示出现自发旋转或偏向左边运动的大鼠(3级)，都同时伴有左侧前肢屈曲，肩内收以及左侧面的推抵抗力减弱，均出现明显的脑梗死区。而仅出现后者的大鼠(1-2级)，并不能确保有满意和有效的MCA的闭塞，仅约有29%出现明显的脑梗死区。所以，没有出现旋转或偏向左边运动的大鼠，需从后续的实验中被剔除，以避免增大各组间的差异和导致对最终实验结果的误解。我们认为MCAO后2h进行神经功能缺陷评分，以评分为3级作为模型成功的判定标准是较为可靠的。
VIP具有多种生物学功能，自其被发现以来，VIP对神经系统的保护和营养作用不断为人们所认识，在体外被广泛研究。这些研究已在近期的综述文章中得到[1]。例如，VIP可以阻止河豚毒诱导培养的脊髓神经元损失；促进胶质源性营养物质的释放，如IL?6、BDNF、NT?3和活性依赖性神经营养因子(activity?dependent neurotrophic factor, ADNF)等。另外，有体外研究发现VIP能增强与神经元共培养的AS摄取谷氨酸的能力[4]，消减谷氨酸介导的神经元的一氧化氮合酶(NOS)变构激活，从而减少NO产生[5]，对抗谷氨酸诱导的细胞死亡。本研究结果显示大鼠侧脑室内注射VIP后脑梗死体积明显缩小，较缺血对照组大鼠减少约25%。我们通过活体实验提供了一个VIP在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用的实证。这为进一步研究VIP在脑缺血损伤的作用机制奠定了理论基础。
脑内S100β主要分布于神经胶质细胞，是AS激活的标志之一。正常情况下S100β不能通过血脑屏障，成人血清中含量极低且相对稳定。病理条件下，细胞破裂或血脑屏障通透性增强时，S100β渗漏到胞外或从脑脊液通过损伤的血脑屏障向血液移行，所以血清S100β浓度升高提示细胞坏死增加或血脑屏障的通透性增强。大量研究结果显示S100β在脑组织、脑脊液和血清中的浓度与患者脑梗死体积大小和预后状况呈正相关。目前，已被看作是脑缺血损伤的比较特异和灵敏的生化标志之一[6]。本实验结果显示S100β不仅是反应脑损伤程度的特异蛋白，而且也可作为脑保护效果的评价指标。
脑缺血后S100含量增高的机制仍不清楚。一些研究提示可能与缺血后大量谷氨酸刺激AS合成增多和缺血区AS坏死释放量增大有关[7?8]。VIP对脑缺血后S100的影响迄今仍未见相关报道。我们的实验结果表明VIP脑内注射可以明显降低血清S100β的含量，其作用机制仍待阐明。体外研究显示低浓度S100β具有神经保护作用，高浓度的S100β具有神经毒性[9]，可升高神经元内钙离子的浓度，引起钙超载，诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS) 的表达，导致AS和培养的神经元死亡[10]。MCAO后反应性AS产生的S100β在梗塞周围区域的蓄积与迟发性梗死灶扩展有关[8]，提示S100β对缺血损伤的和转归有着重要的影响。VIP影响脑缺血后S100β的含量，从而降低S100β毒性作用，可能是VIP的另一神经保护机制。这还有待进一步地研究和证实。
【】
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