Desmin基因exon6 A360P错义突变与克山病的关系

                           作者：张洁　刘作功　郭雄　赖江华 

【摘要】  　　目的 探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生的关系。方法 采用临床流行病学方法调查，随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者、病区正常组和非病区正常组各30例血样，提取基因组DNA，采用PCR扩增、酶切、电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果 慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变位点。结论 Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病心肌损伤的易感基因突变。

【关键词】  克山病； Desmin基因；易感基因；

　　克山病与扩张性心肌病(dilated?cardiomyopathy, DCM)的主要病理变化均为心肌的变性、坏死、纤维化(替代瘢痕)，最终导致心脏功能失代偿 [1]，两病在心肌病变化、临床症状体征上均缺乏特异性的鉴别诊断指标[2]。近年来已发现一些与DCM相关的基因突变，如细胞骨架蛋白基因(desmin、dystrophin、lamin A/C、δ?sarcoglycon、Metavinculin等)和心肌肌小节成分蛋白基因(Actin、a?tropomyosin、Tro?ponin T、β?MHC、Titin、cMyBP?C、MLP等)[3?4]。国内报道[5]克山病患者心肌组织中Desmin荧光染色明显异常，离病灶越近Desmin改变越明显，且与病程成正相关，以慢型克山病多见。已知desmin基因的多个突变中，exon6错义突变与DCM相关性较大，但与慢型和潜在型克山病的关系仍不明确。为此，本调查采用PCR和凝胶电泳的方法检测慢型和潜在型克山病患者中是否存在与DCM患者相同的desmin基因exon6错义突变，以寻找可能的鉴别诊断指标。

　　1  材料与方法

　　1.1  调查对象与分组  选取陕西省黄陵县店头镇各乡296例、非克山病病区西安市长安区 30例为调查对象，依据《克山病诊断标准》(标准编号：GB1702121997)，检出慢型和潜在型克山病患者 82例，临床表现主要有心律失常、多发性室早、房颤等 ，其中慢型克山病患者占4.7% (14例)，潜在型患者占23.0% (68例)。随机抽取克山病患者组30例(病例组)，病区内正常对照组30例(内对照组)。非病区正常对照组30例(外对照组)。方差分析病例组与其他两组年龄和性别没有显著性差异。

　　1.2  样品采集与处理  使用含知情同意书的统一调查表进行调查后，采集肘静脉血5mL，EDTA抗凝，冰块保存运输，置-25℃冰箱低温保存。

　　1.3  实验方法

　　1.3.1  外周血DNA的制备  血样采用盐析法制备DNA，用于做PCR扩增和基因突变的酶切分析。

　　1.3.2  Desmin基因突变位点与引物序列选择  Desmin的基因组DNA全长11990bp，有9个外显子，其中exon6的突变类型为A360P位点错义突变，exon6上、下游引物序列来源于[6] ，分别为5′?CCTCTCCTGCAGAACGATTC?3′；5′?TCCTGCCTGGCCCCTCAC?3′。含exon6的片断长度为250bp，如果在基因组DNA的6211位点发生A360P错义突变，则用内切酶Bsp1286I可将该片断切开为两个分别为184bp和66bp的片断[7]。为保证实验体系及内切酶的有效性，特设定内对照。选择内切酶Bsp1286I，将desmin基因序列输入相应软件中，可看到酶切位点在5407，而5407位点位于exon4片段内，故用PCR扩增exon4片段，可被Bsp1286I切为长度分别为60bp、122bp两个片断。Exon4的引物来源于文献[7]，序列为5′?AAGCCCAGTCATGCCCTACA?3′， 5′?CTTCGACTTGTACCACTCCTCAGC?3′。

　　1.3.3  Desmin基因PCR扩增步骤  标准的PCR反应体系： 20μL模板DNA为200ng 基因组DNA，Tris?HCL(pH8.4) 20mmol/L、KCl 50mmol/L、MgCl2 1.5mmol/L、dNTP各50μmol/L，正反义引物各0.2μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5u 。PCR反应条件：94℃变性30s ；57℃退火30s ；72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，循环30次。对PCR扩增的基因片断exon6及内对照 exon4选用限制性内切酶Bsp1286I进行酶切。

　　1.3.4  琼脂糖凝胶电泳及银染  配制1.5g/L琼脂糖用于电泳，50V电压，电泳20-40min。

　　1.3.5  分析、比较各组酶切图谱。

　　2  结果

　　2.1  exon4酶切位点分析  Bsp 1286I将内对照exon4片段酶切为60bp和122bp两个条带(图1)。

　　2.2  克山病组、病区正常对照组和非病区对照组exon6片断酶切结果  见图2、3，各组酶切前、后均只有一条250bp条带。比较3组电泳结果，desmin基因exon6片断均未被Bsp1286I内切酶切开。

　　图1  内对照组exon4被Bsp1286I酶切鉴定结果（略）

　　Fig.1  Identification of exon4 by restriction endomuclease Bsp1286I

　　图2  克山病患者exon6片断酶切前PCR电泳图（略）

　　Fig.2 Electropherogram of exon6 in keshan disease cases before incided by Bsp1286I

　　M: DL 2000 marker; 1-22: the cases of keshan group

　　图3  各组exon6片断被Bsp1286I酶切鉴定结果（略）

　　Fig.3 Identication of exon6 in different cases digested with Bsp1286I

　　M: DL2000 marker; 1-16: the cases of people in the group.

　　A: keshan group; B: normal control in the area of keshan; C: normal control in the area of non?keshan

　　3  讨论
   
　　慢型克山病与DCM除地区分布不同外，其心肌病变化、临床症状体征上均具有许多相似的表现[8]。尽管克山病心肌组织中desmin蛋白荧光染色出现明显异常，但在本次调查中未能证实慢型和潜在型克山病患者desmin 基因exon6出现A360P错义突变引起的蛋白变性，表明desmin基因exon6的A360P错义突变与慢型克山病心肌损伤关系不密切。有调查报道[4]DCM家族中先证者与其发病同胞中有desmin基因A360P和N391I错义突变，酶切分析显示少数亲属可出现其中的一种突变，但未发病，说明A360P错义突变有一定的外显率。同时在211例健康对照者中未发现其中任一种错义突变，提示该突变非一般的基因多态性表现。有这两种错义突变的DCM患者多表现传导缺陷、偶发性昏厥和心衰等。在限制型心肌病心肌细胞中亦可见到类似的改变，可能是遗传基因异常所致心肌结构蛋白质desmin蓄积，破坏心肌纤维正常结构，影响其收缩及舒张，进而参与疾病的发生[8]。因此，初步分析认识到慢型克山病心肌损伤可能与DCM有不同之处。
   
　　基因突变本身发生概率很低，样本量不足的情况下，难以发现阳性突变，本次调查随机抽取慢型克山病患者30例，病区对照30例和非病区正常对照30例。有报道认为特发性扩张性心肌病发病率约3.65/10000，其中只有20%- 30%有家族聚集现象[9]。在较低发病率的情况下发现突变的概率也随之减低。因此，本次调查慢型克山病患者未检出exon6的A360P错义突变，难以排除因样本含量较少而未检出阳性改变的可能性。其次，可导致扩张性心肌病的基因突变较多，其中在desmin基因的9个外显子中，仅仅exon6上已知和DCM有关的基因突变就有A360P和N391I错义突变。所以虽然本次调查未发现慢型克山病有exon6位点A360P错义突变，但还不能排除其他位点有基因突变的可能性。

【】
  　　[1]夏德义, 张卫星. 克山病、扩张性心肌病诊断与鉴别德几个问题探讨 [J]. 地方病防治杂志, 1998,13(1):13?15.

　　[2]江. 论扩张性心肌病与慢性克山病病理形态学区别 [J]. 中国地方病防治杂志, 1998, 13(1):66?67.

　　[3]Lev GG, Kye?YP. Missense mutations in desmin associated with familial cardiac and skeletal myopathy [J]. Nature Genetics, 1998,19(8):112?115.

　　[4]Kye?YP, Marinos CD. Desmin splice variants causing cardiac and skeletal myopathy [J]. Med Genet, 2000, 37:851?857.

　　[5]钱素娟,于维汉,于祖熙. 克山病患者心肌组织细胞凋亡及结构蛋白Desmin异常表达的研究 [J]. 中国地方病学杂志, 1999, 18(2):22?24.

　　[6]Sugawara M, Kato K. A novel de novo mutation in the desmin gene causes desmin myopathy with toxic aggregates [J]. Neurology, 2005,10(5):987?990.

　　[7]Duanxiang Li, Terry TB. Desmin mutation responsible for idiopathic dilated cardiomyopathy [J]. Circulation, 1999,11(8):462?468.

　　[8]赵春霞, 黎明. 扩张性心肌病基因突变及基因 [J]. 中国分子心脏病学杂志, 2002, 2(5):16?17.

　　[9]陈在嘉. 心血管病与基因突变 [J]. 中国循环杂志, 1999, 14(3):56?57.