助孕胶囊对多囊卵巢大鼠卵巢细胞凋亡的影响
作者：刘润侠 党慧敏 刘艳巧 康晓玲 陈梅
【摘要】 目的 观察助孕胶囊对多囊卵巢(PCO)大鼠血性激素水平及卵巢细胞凋亡的影响，探讨其对PCO模型大鼠的作用并分析其可能的作用机制。方法 采用孕激素联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)造模法制备PCO模型大鼠。随机分为对照组、PCO模型组、中药组(助孕胶囊)、西药组(克罗米酚)，运用放免法测定血性激素水平的变化；采用TUNEL法检测卵巢组织凋亡细胞及免疫组化染色检测卵巢组织颗粒细胞Bcl?2、Bax的表达水平。结果 助孕胶囊可明显降低PCO大鼠血清睾酮T、促黄体生成素LH水平，显著降低卵巢颗粒细胞凋亡率并下调卵巢组织颗粒细胞Bax蛋白的表达。结论 助孕胶囊能够通过调整内分泌及抑制卵巢局部细胞凋亡，在中枢及卵巢局部协调发挥作用，从而调整PCO性腺功能，促进卵泡的发育成熟及排卵。
【关键词】 多囊卵巢综合征；助孕胶囊；性激素；凋亡
The effect of Zhuyun Jiaonang on the ovary apoptosis in polycystic ovary rats
ABSTRACT: Objective To observe the effect of Zhuyun Jiaonang (ZYJN) on procreate endocrine hormone and the expression of ovarian local cytokines in rats with polycystic ovary (PCO), and analyze the possible therapeutic mechanism. Methods The PCO rat models were established by pregnancy hormone combined with human chorionic gonadotrophin (HCG). Then they were randomly divided into four groups, control group, model group, Chinese crude drug group (ZYJN) and western medicine group (CC). The levels of serum gonadal hormone were detected by radioimmunoassay. Using the immunohistochemical staining technique we detected the expression level of apoptosis regulatory protein Bcl?2, Bax and apoptotic index in ovarian granular cell with TUNEL marking methods. Results ZYJN could decrease the level of testosterone (T) and luteotropic hormone (LH) in rat serum and the expression of protein Bax. The apoptosis index (AI) of ovarian granular cells in model group was obviously higher than that in the control group and treatment group (P<0.05). In comparison with model group, the difference was apparent in ZYJN, whose apoptosis index (AI) of ovarian granular cells was obviously lower than the model group (P<0.05). Conclusion ZYJN could play a coherent role in the center and ovary by regulating the endocrine function and affecting the apoptosis of ovarian granular cell in rat ovary, thus adjusting gonadal gland and promoting the maturity and ovulation of follicle.
KEY WORDS: polycystic ovarian syndrome; Zhuyun Jiaonang; gonadal hormone; apoptosis
多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)是一组发病多因性，临床表现多态性的综合征，以雄激素过多和持续性无排卵为临床特征。中药调经促排卵临床疗效确切，助孕胶囊为临床经验方，对PCOS、各种无排卵及排卵障碍导致的月经不调、不孕不育有较好的疗效。基于以往临床观察研究的基础上，本研究通过建立多囊卵巢(polycystic ovarian, PCO)大鼠模型，观察助孕胶囊对PCO模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及其凋亡调控蛋白表达的影响， 以便从分子生物学水平及卵巢局部分析其可能的作用机制，为中药调经助孕提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物、药品及给药方法 健康SD雌性大鼠，体重50g左右(西安大学医学院实验动物中心提供)。中药助孕胶囊由西安交通大学医学院第二附属中药制剂室提供(成分主要为紫河车、鹿角胶、仙灵脾、熟地、女贞子、旱莲草、桃仁、红花、半夏、胆南星等)，0.4g/胶囊，1g胶囊含生药1.575g；克罗米酚由上海衡山药业有限公司生产，产品批号040301，50mg/粒。将动物随机分为4组，分别为正常对照组、模型组、中药组(助孕胶囊组)、西药组(克罗米酚组)，每组各10只。中药组按助孕胶囊生药6g/(kg·d)，西药组按人与大鼠公斤体重折算系数给药，克罗米酚(CC)20mg/(kg·d)。对照组和模型组大鼠同期灌服同体积蒸馏水10mL/kg体重，各组1次/d，共14d。
1.2 动物模型的制作 参照朱辉等[1]的方法，选用24日龄未成年雌性SD大鼠，皮下埋植左旋18?甲基炔诺酮硅胶棒(3mm)，在27日龄时每日皮下注射1.5u人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, HCG)2次，正常对照组每日皮下给注射用水2次，共注射9d。37日龄连续阴道涂片2个性周期。采血，测雄激素(testosterone, T)、胰岛素(insulin, INS)水平。观察到阴道角化细胞持续出现及结合血清T、INS测定，判断PCO大鼠模型是否成功。对照组连续阴道涂片2个性周期，显示完整的动情周期，血清T、INS的测定结果在正常范围。
1.3 血清学指标 末次给药后24h，20g/L戊巴比妥钠0.3mL腹腔麻醉，打开腹腔，腹主动脉取血，离心分离血清，采用放射免疫法检测血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)、促黄体生成素(luteotropic hormone, LH)、雌二醇(estradiol, E2)的水平，由西安交通大学医学院第二附属医院放免检验科按操作程序测定，批内批间误差<10%。性激素放射免疫分析药盒购自拉尔文生物工程技术有限公司。
1.4 病理观察 观察双侧卵巢大体解剖，并取下双侧卵巢组织，用10%(体积分数)的甲醛液固定，常规石蜡包埋、切片，待做HE染色及免疫组织化学分析，光镜观察卵巢的组织形态改变、卵泡的大小发育情况。
1.5 Bcl?2、Bax表达的免疫组化检测 SP试剂盒和Bcl?2、Bax单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，应用DAB显色，均进行抗原修复、HE染色，切片厚4μm，并做阴性和阳性对照。免疫组化结果判定：阳性染色为棕黄色颗粒，特异性位于细胞膜周围。对综合染色强度和分布范围进行半定量评分。评分标准：(-)，无着色为阴性计0分；(+)，染色弱但明显强于阴性对照者为1分；(?)，染色清晰者为2分；(?)，染色强者为3分。无阳性细胞数者为0分；<10%为1分；20%-30%为2分；>30%为3分。上述两种评分相加为表达强度评分。
1.5 卵巢细胞凋亡的检测 TUNEL试剂盒购自福州迈新生物工程公司，经TUNEL法染色后细胞核呈蓝黑色为凋亡细胞，胞核呈浅红色为正常细胞。每个标本观察2张切片，每张切片随机计数6-8个高倍镜视野中凋亡阳性细胞核数目及其占总细胞核数目的比例，求其均值即为卵巢细胞凋亡指数(apoptosis index, AI)。
1.6 统计学处理 所有数据均以均数±标准差(±s)表示，各测量值间的比较用One?way ANOVA方差分析，相关性检验用两变量的相关性分析方法，P<0.05为具有显著性差异。
2 结果
2.1 光镜检测结果 对照组镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，初级卵泡位于浅层，数目较多，体积小，呈圆形或椭圆形。生长卵泡大小不一，位置较深，成熟卵泡多位于浅表部，可见卵泡腔、卵细胞及卵丘结构。颗粒细胞呈多层(多为6-8层)，形态完整，排列整齐，卵泡膜细胞呈梭形排列；模型组镜下见卵泡颗粒细胞减少而膜细胞层增加，后者常发生黄素化，卵巢皮质间质细胞明显增生，其中可见散在丛状的黄素化细胞巢；西药组在镜下仍可见黄素化的膜细胞层增加，卵巢皮质间质细胞增生，同时可见皮质内出现许多初级卵泡、生长卵泡及少量成熟卵泡，颗粒细胞层数增加，泡膜细胞层变薄，黄体组织数量较模型组明显增多；中药组镜下可见皮质内大多数卵泡为正常发育的卵泡，有初级卵泡、生长卵泡及成熟卵泡。颗粒细胞层数明显增加，约为4-5层，形态完整，排列整齐。泡膜细胞层明显变薄，黄体组织数量较模型组明显增多。
2.2 血清性激素的变化 实验数据显示，模型组T、LH水平高于对照组，而FSH、E2水平明显低于对照组，符合PCOS内分泌紊乱的表现特征。中药组大鼠血清T、LH水平明显低于模型组，而FSH、E2水平高于模型组，均具有显著性差异(P<0.05)，西药组大鼠血清E2、FSH水平亦显著高于模型组(P<0.05)，两组之间相比无显著性意义(P>0.05)。而西药组大鼠血清T、LH水平与模型组之间相比则无显著性差异(P>0.05，表1)。
表1 各组大鼠血清性激素的测定结果（略）
Table 1 Results of serum gonadal hormone
*P<0.05 vs. control group; **P<0.05 vs. model group; #P<0.05 vs. CC group; ZYJN: Zhuyun Jiaonang; CC: chloramiphe
2.3 卵巢颗粒细胞凋亡率的变化 实验结果显示，模型组大鼠细胞凋亡指数明显高于对照组(P<0.05)，中药组大鼠细胞凋亡指数显著低于模型组(P<0.05)，而西药组大鼠细胞凋亡指数低于模型组，但无显著性差异(P>0.05，表2)。
2.4 卵巢组织Bax、Bcl?2蛋白表达的变化 免疫组化结果显示，卵巢细胞中均有表达Bax及Bcl?2蛋白，其中，Bax蛋白在模型组大鼠卵巢的表达显著高于对照组(P<0.05)，中药组大鼠卵巢细胞Bax蛋白的表达显著低于模型组(P<0.05)，而西药组与模型组相比，无显著性差异(P>0.05)。而大鼠卵巢细胞Bcl?2蛋白的表达四组之间相比较，均无显著性差异(P>0.05，表2、图1-4)。
表2 各组大鼠卵巢组织Bax、Bcl?2蛋白的表达情况及颗粒细胞的凋亡率（略）
Table 2 Results of the expression of Bcl?2, Bax and AI in ovary granular cells
*P<0.05 vs. control group; **P<0.05 vs. model group; #P<0.05 vs. CC group; ZYJN: zhuyunjiaonang; CC: chloramiphe
图1 模型组大鼠卵巢组织中Bax蛋白的表达情况（略）
Fig.1 Expression of Bax protein in ovary of model group (?) (×400)
图2 中药组大鼠卵巢组织中Bax蛋白的表达情况（略）
Fig.2 Expression of Bax protein in ovary of ZYJN group (+) (×400)
图3 模型组大鼠卵巢组织中Bcl?2蛋白的表达情况（略）
Fig.3 Expression of Bcl?2 protein in ovary of model group (?) (×200)
图4 中药组大鼠卵巢组织中Bcl?2蛋白的表达情况（略）
Fig.4 Expression of Bcl?2 protein in ovary of ZYJN group (?) (×400)
3 讨论
PCOS是妇科内分泌系统最常见的疾病，占育龄妇女的5%-10%[2]，以双侧卵巢呈多囊性改变，伴不孕、多毛、痤疮、肥胖、月经紊乱等一组症状。本实验采用孕激素联合HCG的造模方法，基本原理在于皮埋左旋18?甲基炔诺酮可使E2、P、FSH均呈现低水平，导致不排卵。而HCG在卵泡早期使用可致卵泡闭锁，从而形成多囊卵巢综合征。本实验结果表明：①造模后的大鼠卵巢体积增大，镜下可见颗粒细胞层变薄甚至消失，颗粒细胞排列疏松，膜间质细胞增生，其中可见散在丛状的黄素化细胞巢。说明孕激素联合HCG能够诱发卵巢卵泡发生闭锁及无优势卵泡产生；②造模后的大鼠血T水平明显地高于对照组(P<0.05)。说明本实验所采用的动物模型无论是病理形态学变化还是激素水平均与PCOS非常相似。
PCOS患者生殖功能障碍的主要特征是卵泡发育障碍和无排卵，高雄激素血症是PCOS的基本病理生理改变之一。本研究结果表明助孕胶囊相比克罗米酚(CC)，能显著降低血清T水平，其可能通过使卵泡内合成雌激素的颗粒细胞层变厚，合成雄激素的卵泡膜细胞层变薄，降低多囊卵巢大鼠雄激素水平的同时提高雌激素水平，进而促使卵巢排卵，从而有效调节PCO大鼠T的代谢紊乱。已知PCOS另一个重要的病理特征是垂体促性腺激素分泌的不协调，即LH明显高于FSH，LH/FSH>2-3，并缺乏排卵前LH峰。本实验结果表明，助孕胶囊能够降低LH、LH/FSH水平，从而促使建立正常的反馈作用，恢复性腺的正常调节。其作用途径可能为：①方中的补肾中药能在多个环节调节性腺轴的功能，其中包括调节下丘脑GnRH的分泌、垂体LH、FSH的释放、卵巢性激素的合成和分泌，并可调节垂体对 LH?RH的敏感性、卵巢对LH的反应性及卵巢受体的形成[3?4]；②方中的温补肾阳中药能够增强性腺轴的功能，促进卵泡发育和排出，提高血浆E2水平[5]。
近年来研究表明，在卵泡发育过程中，颗粒细胞的增殖、分化起着重要的作用，颗粒细胞大量凋亡将会影响卵泡的正常发育成熟过程[6]。颗粒细胞凋亡的发生被抑制或加速时，Bax基因表达产物变化均显著[7?9]，提示Bax基因在影响颗粒细胞生存和凋亡中起决定作用。从本实验结果进一步证实了在PCOS中，主要是由于Bax蛋白表达的上调，致使颗粒细胞凋亡的发生增多，从而导致过多的卵泡发育停滞、闭锁。而中药组大鼠颗粒细胞凋亡指数及Bax蛋白的表达均显著低于模型组，说明助孕胶囊主要通过降低促凋亡基因Bax蛋白在卵巢颗粒细胞上的表达，减少PCO大鼠颗粒细胞凋亡过多发生，进而抑制卵泡闭锁，促使卵泡发育成熟，诱发排卵。
PCOS属中医学“不孕”、“闭经”、“崩漏”“癥瘕”范畴。根据宏观辨证及微观辨证，近年来的中医研究资料认为其病机与肝、肾、脾三脏功能失调及痰、湿、气、血的瘀滞密切相关。本方由紫河车、鹿角胶、仙灵脾、半夏、天南星、熟地、女贞子、旱莲草、当归、芍药、桃仁、红花、香附等中药组成。方中以紫河车、鹿角胶、仙灵脾补肾助阳、益精添髓；半夏、天南星燥湿化痰、消痞散结；女贞子、墨旱莲、熟地补肝肾、益精血与补肾阳药同用，取其肾中阴阳互相依存，又互相转化，从而促进卵泡的成熟；中医理论认为卵泡的发育、排出除依赖肾气旺盛之外，还离不开肝之疏泄，在加以不孕患者多精神紧张，盼子心切，故常兼见肝气郁结，而女子又以血为用，月经、胎孕均以血为主，故配以当归、芍药以养血柔肝；桃仁、红花活血通经，行气祛瘀以促肾中阴阳气血转化，使阳气渐旺，促使成熟的卵泡排出；香附与桃仁、红花合用，以理气活血、祛瘀软坚。全方配伍具有补肾祛痰，活血化瘀之功，药后则痰瘀祛，经脉通，气血畅，月事下，达到恢复排卵的目的。
本实验研究了助孕胶囊对PCO大鼠卵巢卵泡发育、血清性激素水平及卵巢组织细胞凋亡及凋亡调控蛋白Bax表达水平的影响，其结果表明助孕胶囊可通过降低PCO大鼠血清T、LH水平及抑制卵巢细胞Bax蛋白的表达，从而达到减少卵巢细胞凋亡，改善PCO卵泡的发育，促使优势卵泡的产生，进而诱导排卵。提示补肾祛痰，活血化瘀方药助孕胶囊是多囊卵巢综合征的有效方药。
【】
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