DXS6804基因座等位基因分型标准物的克隆制备及其群体遗传学研究

【摘要】  　　目的 用分子克隆技术制备DXS6804基因座等位基因分型标准物，并用于云南普米族人群的群体遗传学研究，解决长期困扰短串联重复序列分型上存在的准确性和标准化问题。方法 用PCR扩增出DXS6804基因座的各等位基因片段，PCR产物克隆后，DNA测序证实插入片段的大小和结构，按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后，制备出该基因座的等位基因分型标准物，进行群体研究。结果 调查了中国云南地区普米族人群基因座的基因型分布频率，发现DXS6804基因座两个分型标准物外等位基因。结论 分子克隆技术是制备等位基因分型标准物的可靠方法，DXS6804基因座是一个适合我国法医学和群体遗传学分析的遗传标记。

【关键词】  等位基因分型标准物；短串联重复序列；遗传多态性

　　Study on the construction of standard DXS6804 allelic laddervia molecular cloning and its genetic polymorphism　in Chinese yunnan pumi populations

　　ABSTRACT: Objective  To resolve the problem of the accuracy and standardization of STR?PCR typing in forensic practice, construct DXS6804 allelic ladder by molecular clonning and apply them in a population study on the Pumi population in Yunnan, China. Methods  PCR was used to produce several different allelic fragments of the locus. After cloning the PCR products, the recombinant plasmids were sequenced. Then we denominated them and used them as template for re?amplification to generate the locus standard ladder. Results  The sequencing results confirmed that the size and the construction of the inserts were correct. The genetic polymorphisms of this locus in Yunnan Pumi population of China were studied. Two off?ladder alleles of DXS6804 locus were found. Conclusion  This method is of high value for forensic DNA typing to construct standard ladders. DXS6804 is robust for genetic research and forensic application.

　　KEY WORDS: allelic ladder; short tandem repeats; genetic polymorphism

　　短串联重复序列(short tandem repeats, STR)是一类在人类基因组中分布广泛并且具有高度多态性的遗传标记。具有分型检测所需检材量少、尤其适合降解DNA的扩增等优点，被广泛应用于法医学个体识别和同一认定以及民事案件中的亲权鉴定[1?2]。特别是X染色体STR基因座，具有扩增片段短、等位基因多、分型方法简单、多态信息含量高的优点，更受到格外关注。而且它特别适用于法医学实践中在母方缺如(去世或失踪)情况下兄弟姐妹的亲权鉴定，另外，也可以作为性别的辅助鉴定，为法医学研究提供了一种新的工具。但是，由于目前已知的X染色体多态性遗传标记的数量较少，适用于法医学的更少，而且其研究方法还处于摸索阶段[3]。
   
　　等位基因分型标准物(allelic ladder)是人群中常见的等位基因混合物，用来与未知样品比对确定基因型。只有具备了一套精确的、国际标准化命名的标准参照物，才有可能对STR分型结果作出正确的判型和命名,STR数据才能在各实验室之间进行交流和合作[4]。为此，我们应用分子克隆技术，在国内外首先制备出DXS6804基因座的等位基因分型标准物。应用自制的等位基因分型标准物，首次调查了中国云南地区普米族人群基因型分布频率，评价该基因座在法医学和群体遗传学中的应用价值。

　　1  对象与方法

　　1.1  对象

　　1.1.1  样本  遵循知情同意原则，随机抽取中国云南地区100名普米族(其中女性49名)群体中无亲缘关系个体的静脉血，EDTA抗凝，-70℃保存。

　　1.1.2  引物  引物序列查自GenBank(表1)，由奥科公司合成。

　　1.1.3  试剂  2X Taq polymerase mix和DH5α感受态细胞(天为时代公司)；质粒纯化试剂盒(Qiagen公司)；pGEM??T Easy Vector SystemⅠ(美国Promega公司)；聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(Biospin公司)；EDTA等其余试剂均为国产分析纯。

　　1.1.4  仪器  台式高速离心机(德国Hermle公司)；微量可调加样器(10、20、50、100、200、1000μL)(法国Gilson公司)；三相恒压电泳仪(美国Bi a?Rad公司)；干热器(美国Bellco公司)；旋涡混匀器(日本Tomy kogyo公司)；超净工作台(中国扬州医疗设备厂)；低温冰箱(-30℃，-70℃)(日本Sanyo公司)；ABI3730自动测序仪(美国ABI公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  制备标准分型物模板DNA  通过Chelex?100法[5]提取云南普米族群体样本DNA，PCR扩增。反应体系：总体积13μL， 2×Taq polymerase mix 6μL，引物1μL(5nmol/L)，DNA 2μL，H2O 2μL。反应条件见表1。
   
　　用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，银染显色[6?7]。从群体样本的扩增产物中，选出了9个不同大小片段长度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒纯化各个片断，制备成PCR再扩增的模板。

　　1.2.2  PCR再扩增、产物鉴定及纯化  将制备好的9份DNA进行扩增，反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后再确定其片段大小，并进行纯化。

　　1.2.3  PCR产物的克隆  采用pGEM??T Easy Vector SystemⅠ克隆试剂盒，将纯化后的PCR片段直接插入质粒的多克隆位点。重组后的质粒转化DH5α感受态细胞，选择培养，再用以上的扩增方法筛选出含有正确插入片段的克隆。

　　1.2.4  重组质粒的DNA测序  采用ABI3730全自动遗传分析仪，以质粒公用的M13正向引物对重组质粒的插入片段进行测序，确定插入片段的大小及组成，以国际法庭血液遗传学学会(international society of forensic haemogenetics, ISFH)推荐的命名原则进行各等位基因命名[8?9]。

　　1.2.5  重组质粒的扩大培养及保存  对经测序证实的含有正确等位基因插入片段的质粒扩大培养。提取质粒后,得到该基因座的等位基因分型标准参照物的重组质粒。菌液加甘油后，-70℃保存。

　　1.2.6  等位基因分型标准物的制备和再鉴定  以含该基因座等位基因插入片段的重组质粒DNA为模板,进行PCR扩增，反应体系及条件如前。纯化该基因座各等位基因的PCR产物，混合制备成等位基因分型标准物,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，验证所得分型标准物的可用性。
   
　　将用分子克隆技术制备出的DXS6804基因座等位基因标准分型物用于云南地区普米族群体的遗传学研究。

　　1.2.7  数据分析  利用SPSS12.0统计学软件该基因座等位基因片段的频率和基因型频率。利用χ2检验进行Hardy?Weinberg平衡吻合性检验[10]。根据等位基因和等位基因型频率，分别计算杂合度(H)、个人识别力(DP)、多态信息量(PIC)[11?12]。

　　2  结果

　　2.1  重组质粒插入片段的序列分析及DXS6804的阶梯状分型标准物的制备  用ABI3730测序结果证实，DXS6804的7个插入片段是以四核苷酸GATA为核心序列重复10-16次，其长度为173-197bp，与GenBank中公布的数据完全一致。根据ISFH规定的命名原则，插入片段的等位基因分别命名为10-16。用分子克隆技术制备的等位基因分型标准物见图1。
   
　　另外，在制备等位基因分型标准物的过程中，发现两个分型标准物外等位基因(off?ladder allele, OL allele)[13](图1)，经测序知它们的核心序列GATA重复次数分别为8次和7次。这些等位基因频率一般较低，其对法医亲子鉴定和个体识别的贡献远大于一般的等位基因。因此，对OL等位基因进行系统研究，有重要的实践意义。

　　2.2  分子克隆制备的DXS6804基因座分型标准物应用于群体的研究结果  将制备的DXS6804阶梯状分型标准物用于云南地区普米族群体，分别检出9种等位基因以及14种不同的基因型，等位基因频率分布范围分别为0.0100-0.4068。基因型频率范围分别为0.0244-0.1707，各基因座的具体遗传学和法医学信息见表2和表3。

　　表1  DXS6804基因座的引物信息及扩增条件（略）

　　Table 1  Primer information and amplification condition of the locus

　　表2  DXS6804基因座在普米族人群中的基因频率（略）

　　Table 2  Gene frequency in Pumi population of the locus

　　表3  普米族女性DXS6804基因座的基因型频率分布（略）

　　Table 3  Genotypic frequency in Pumi female population of the locus

　　表4  DXS6804基因座在普米族人群中的统计数据（略）

　　Table 4  Statistical data in Pumi population of the locus

　　H: heterozygosity; PIC: polymorphism information content; PDF: power of discrimination in females; PDM: power of discrimination in males

　　图1  DXS6804等位基因分型标准参照物电泳分型结果（略）

　　Fig.1 The electropherotyping results of DXS6804 allelic ladder

　　M: the mixture of DXS6804 allelic ladder; 1-9: the fragments amplified by recombinant plasmid;1-7: the repeat structure (GATA) range from 10-16; 8,9: the OL allele, the repeat frequency of (GATA) is 8,7 for each

　　3  讨论

　　3.1  分子克隆技术制备STR分型标准物的优势  STR应用于法医学分型检测时，要求准确、快速、方便，对其分型结果的准确性、公正性和可靠性的要求更高。由于STR的分析主要采用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AMP?FLP)和电泳技术进行分型，因此，只有具备了一套精确的、国际标准化命名的分型标准物，才有可能对STR分型结果做出正确的判型和命名，才可能在各国、各实验室之间得到可重复性的结果。
   
　　分子克隆技术在等位基因分型标准物制备中有如下优势[14]：①通过重组质粒可永久保存STR基因座的等位基因，等位基因片段的重组质粒库的建立可实现分型标准物的永久同一性；②以极少量装载有STR等位基因片段的重组质粒为模板，通过PCR扩增可获得大量的等位基因片段；③小片段的等位基因片段被装载入质粒后，可以用质粒测序的公共引物完成对其序列结构的分析。所以，此法制备的STR基因座等位基因分型标准参照物中的等位基因片段均能够按照国际统一标准命名，适合于各种片段大小基因座的标准参照物的制备。
   
　　然而，该方法对实验室装备要求高，前期实验费用较大，制作工序及时间较多，对实验过程操作和防污染更加严格。

　　3.2  DXS6804基因座的应用价值  应用分子克隆技术制备的DXS6804基因座的等位基因分型标准物对云南普米族人群该基因座的群体资料进行调查。结果表明，在普米族群体中，DXS6804基因座的杂合度为0.7364，多态信息量为0.6954，个人识别力均大于0.5170。经χ2检验符合Hardy?Weinberg平衡定律，说明该基因座在云南普米族人群中具有较好的法医学和群体遗传学应用价值，是一个可用的等位基因分型标准参照物，为进一步对其他群体的研究提供了标准，也为DXS6804基因座在不同实验室之间的比较和交流提供了参照标准。

【】
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