深圳地区淋球菌营养分型和抗生素耐药性的研究
【摘要】 目的：为了解深圳地区淋球菌的营养型分布和4 种抗生素的耐药性。方法：对深圳地区113株淋球菌进行MIC测定和PPNG检测，同时对其中113株淋球菌进行营养分型检测。结果：113株淋球菌中检出PPNG菌株9株，TRNG菌株16株，青霉素耐药菌株73株(64.60%)，环丙沙星耐药菌株88株（77.88 % ），大观霉素、头孢曲松未发现耐药菌株。113株淋球菌分16种营养型，以 Pro?型、Proto? 型、Pro?lle型、Lle?型、Pro?lle Ser型5种营养型为主，占86.73%，其余11种营养型占13.27%。青霉素和环丙沙星的耐药菌株主要分布于Pro?型中，TRNG菌株主要分布于Lle?型，PPNG菌株散在于各种营养型中。结论：深圳地区淋球菌的营养型和耐药性的分布状况，有助于本地区淋球菌的流行病学研究和淋病防治。
【关键词】 淋病奈瑟氏菌； 营养型； 耐药性
Research for Distribution of Auxrypes and Antibitic Resistance of Neissia Gonorrboeae in Shenzhen
Abstract: Objective To invesligale distribution of auxlypes and antibiolic resislance of Neissia gonorrboeae in shenzhen. Methods One hundred and thirteen isolales of N.gonorrhoeae were delermined for MICs and PPNG, among which 113 were auxolyped. Results It was showed that 9 strains from 113 strains were PPNG, 16 TRNG, 73 penicillin?resistant strains(64.60%), 131 ciprofloxacin?resistant strains.No strains were found to be spectinomycin or cefotriaxon resistang, One hundred and thirteen strains were classified into 16 auxotypes,most of which pertained to such five auxotypes as pro?,proto?,pro?lle?,lle?,pro?lle?ser?, accounting for 86.73% and the other 11 auxolypes contributed the rest of 13.27% .The most of penicillin and ciprofloxacin resistant stains belonged to Pro?,and TRNG strains to Lle?,and PPNG strains showed various auxotypes. Conclusion The study represented the distribution of auxotypes of N.gonorrhoeae and its susceptibility.It is helpful for the study of emidemiological research and control of gonorrhea in Shenzhen.
Key words: Neisseria gonorrhoeae;Auxotype;Susceptibility
淋病是我国性传播疾病的主要病种,越来越引起人们的广泛关注,淋球菌是淋病的病原菌。淋病过程中抗生素的滥用以及用药的不规范，产生了新耐药菌株和新的耐药谱，给临床治疗带来了困难。本文对2005年4月至2006年4月深圳地区的淋球菌营养型和耐药性进行研究，现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
实验菌株均从我区门诊患者的泌尿生殖道分泌物中分离，所有菌株经革兰染色、氧化酶试验和糖发酵试验证实为淋球菌后传代一次，洗于脱脂牛奶中，于-78℃低温冰箱冻存备用。
1.1.2 抗生素
大观霉素由美国UpJohn公司生产，头孢曲松为瑞士Roche公司生产，四环素、青霉素、环丙沙星由澳大利亚威尔士亲王 Tapsall博士提供。
1.1.3 培养基
@A基础培养基(OXOID)公司生产加入脱纤维新鲜羊血。
1.1.4 标准菌株
WHO A、B、C、D、E标准淋球菌菌株及营养型的CDC标准菌株由医学院皮肤病研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 最低抑菌浓度（MIC）测定
采用WHO西太区淋球菌耐药监测规划推荐的琼脂稀释法。即先将4种抗生素按要求配成原液，再倍比稀释成不同的浓度。将3.7%GC基础琼脂高压灭菌，水浴冷却至50℃，加入脱纤维新鲜羊血 (终浓度10%)。取0.1 ml倍比稀释好的4种抗生素工作液，加入10 ml血液基础培养基，混匀后倾倒平板，从低浓度至高浓度配制各种浓度的平板，实验菌株和标准菌株用18 h~24 h的淋球菌菌苔，制成10 cfu/ml的菌悬液，用多头接种器将菌悬液接种于各种浓度的平板，置36℃、5%CO2环境下培养，36 h后观察结果，记录无菌落生长的最低抑菌浓度。以WHO A、B、C、D、E标准菌株作质控。
1.2.2 β?内酰胺酶测定
采用纸片碘量法测定菌株的β?内酰胺酶，即取一试管，加入2滴100 000 U/ml的青霉素溶液，2滴1%淀粉溶液，1滴碘试剂，呈蓝色混合物，在一滤纸条上滴一滴试剂，将一接种环培养物涂在蓝点上，放置1 min~2 min，如蓝色变成无色即为β?内酰胺酶阳性菌株，颜色无变化则为阴性。每次试验以WHO E株作阳性对照，A株作阴性对照。
1.2.3 营养分型
分型培养基：按［1］介绍的方法制备。完整 GGM（gonococcal genetic medium）含有谷氨酸、精氨酸（Arg）、 蛋氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸、丝氨酸 （Ser）、异亮氨酸 （Lle）、胱氨酸和半胱氨酸8种氨基酸，次黄嘌呤（Hyx）和尿嘧啶（Ura）2 种碱基，以及琼脂、可溶性淀粉、维生素和辅酶等。非完 整GGM培养基（营养分型培养基）；完整GGM培养基缺少上述某一氨基酸或碱基。分型方法：复活冻存菌株，于GC培养基传代后，取18 h~24 h培养物制备成菌悬液，分别接种于完整GGM平板和各分型平板，CO2环境下36℃培养24 h后观察结果。根据菌株在不同培养基上的生长情况判读其营养型，在所有营养分型培养基上均生长者为Proto（原型），在某一分型培养基上不生长者记为如Ura?（尿嘧啶）、Pro?（脯氨酸）、AHU?（精氨酸、次黄嘌呤和尿嘧啶）。每批试验均以CDC 标准营养分型菌株进行质量控制。
2 结果
2.1 β?内酰胺酶（PPNG）测定结果
113株淋球菌中检出9株（7.96%）产青霉素酶淋球菌（PPNG）。
2.2 TRNG测定结果
113株淋球菌中检出16株四环素MIC≥16 mg/L的菌株，占14.15%。
2.3 113株淋球菌MIC测定结果
青霉素MIC≥2 mg/L耐药菌株73株（64.60%），环丙沙星MIC≥1 mg/L的耐药菌株88株占（77.88%）。大观霉素、头孢曲松未发现耐药菌株。
2.4 营养分型结果
113株共分为16种营养型，其中 Pro?型33株（29.20%）、Proto? 型23株（20.35%）、Pro?lle型22株（19.47%）、Lle? 型13株（11.50%）、Pro?lle Ser 型7株（6.19%）。 5种营养型共占86.73% ，其余11种营养型15株共占（13.27%）散发存在。
2.5 营养型分布
113株淋球菌中 Pro?型33株，其他营养型80株，青霉素和环丙沙星的耐药株主要集中于Pro?型，113株淋球菌中有PPNG菌株7株，TRNG菌株13株，TRNG菌株主要集中于Lle?型。
3 讨论
淋病是目前世界上发病人数最多的性传播疾病之一，淋球菌的营养型和耐药性因菌株分离的时间和地点的不同而有所差异。国外认为采用营养分型结合耐药性、质粒图谱分型和血清学分型能更好地反映一个地区的淋球菌菌株流行状况，使菌株的特征更为细致，有助于淋球菌的流行病学监测。本试验结果表明，深圳地区营养分型为Pro?型、Proto?型、Pro?lle型、Lle? 型、Pro?lle Ser 型 5种营养型为主共占86.73%，其余11种营养型占13.27%，与国内报告基本一致［2，3］。国外报道［4］Pro?型菌株对青霉素、四环素等抗生素敏感性下降。本试验结果显示，抗生素耐药性测定结果与营养分型结果相符，青霉素和环丙沙星耐药菌株集中在 Pro?型，与国外报道相符，与国内苏晓红［5］的观点大致相同。TRNG 菌株主要集中在Lle?型，深圳地区Lle?型流行率为11.4%，TRNG流行率为9.6%明显高于国内其他地区的报道，应该引起重视。
随着喹诺酮类药物的广泛使用，喹诺酮类药物的耐药率逐年增加，许多地区分离出MIC>16 mg/L的环丙沙星高度耐药株。本文结果检出检出16株四环素MIC≥16 mg/L的菌株，占14.15%；环丙沙星高度耐药，耐药率为 77.88%。通过对4种抗生素的监测头孢曲松、大观霉素未发现耐药菌株，因此头孢曲松、大观霉素应是目前淋病的首选药物。
【文献】
［1］La scolea CJ,Young FE.Development of a defined minimal medium for growth of Neisseria gonorrhoeae［J］.Appl Microhiol，1974,28(1):70?76.
［2］王千秋，叶顺章，陈平，等.营养分型法对淋球菌流行菌株的监测［J］.皮肤性病学杂志，1996,10(2):69?70.
［3］吴红，朱道银.淋球菌营养型与耐药性及质粒的关系［J］.中华皮肤科杂志，1998,31(3):163?165.
［4］Peeters MF,Frost EH,Ossari SA,et al. Antibiotic susceptibility in relation to serogroup and auxotype of Neiseria gonorrhoeae isolates form Gabon［J］.Sex Transm Dis,1987,14:130?131.
［5］苏晓红，叶顺章，陈平，等.淋球菌对五种抗生素的敏感性测定及营养型分布［J］.中华皮肤科杂志,1996,29(3):163?165.
