宫颈鳞癌中凋亡调控基因蛋白的表达及其临床病理意义
作者：李海，邓志勇，陈金珍，张阳，徐松，郑晓娟
【摘要】 目的：探讨宫颈鳞状细胞癌中凋亡凋控因子Survivin、Caspase?3、p63、bak 蛋白的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学技术检测40例宫颈鳞状细胞癌及10 例正常宫颈组织中Survivin、Caspase?3、p63、bak的表达水平。结果：Survivin蛋白在宫颈癌中表达高于正常宫颈组织(P<0.05)；Caspase?3的表达低于正常宫颈组织(P<0.05)；p63蛋白的表达水平高于正常宫颈组织(P<0.05)；bak蛋白的表达水平低于正常宫颈组织(P<0.05)。Survivin、Caspase?3、p63、bak蛋白的表达水平在不同分化程度的宫颈癌之间的差异有显著意义(P<0.05)。结论：宫颈鳞状细胞癌的发生、与Survivin、Caspase?3、p63、bak蛋白的异常表达有关，可能是细胞异常增殖和凋亡失衡的结果。
【关键词】 宫颈；鳞状细胞癌；Survivin；Caspase?3；p63；bak；免疫组化；表达；意义
Expression and Clinical Opathological Significance of Regulators and Effector in Cervical Squamous Cell Carcinoma
Abstract: Objective To investigate the expression and significance of regulators and effector of Survivin、Caspase、p63、bak in cervical squamous cell carcinomas. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression of regulators and effector of Survivin、Caspase?3、p63、bak in 40 cases of cervical squamous cell carcinomas,10 normal cervical tissues.Results Expression of Survivin were observed in cervical carcinomas,that is higher levels in cervical carcinomas than in normal cervical tissues (P<0.05),Caspase?3 is lower levels than in normal cervical tissues (P<0.05). p63 is higher levels than in normal cervical tissues (P<0.05), and bak is lower levels than in normal cervical tissues (P<0.05). Significant differences were observed for Survivin、Caspase?3、p63、bak expression levels in different differentiated cervical carcinoma(P<0.05).Conclusion The abnormal expression of Survivin、Caspase?3、p63、bak may be a positive factor in the pathogenesis of cervical squamous cell carcinomas .The results suggest that cervical squamous cell carcinomas may result from abnormal preliferation and unbalanced apoptosis.
Key words: Cervical;Squamous cell carcinomas; Survivin;
Caspase?3; Immunohistochemistry; Expression; Significance
目前对宫颈癌的发生、发展已进行多方面的研究,Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子。具有参与细胞周期调控及调节细胞有丝分裂等多种生物学作用。细胞凋亡的异常与肿瘤发生发展密切相关,而Caspase?3 在凋亡过程中起着重要的作用。p63是新发现的p53蛋白的同源蛋白,可能参与上皮组织的正常发生和分化以及形态学的发生,并可以促进肿瘤的生长。bak作为Bcl?2基因家族促凋亡基因的代表，在细胞凋亡过程中起着重要的作用。为此,我们应用免疫组织化学方法检测宫颈鳞癌组织中Surviving、Caspase?3、p63、bak蛋白的表达,以探讨其在宫颈癌中的表达和意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象
标本取自本院病理科2004年至2007年期间活检或手术宫颈鳞癌标本,共计40例,同时选正常宫颈组织10例作为对照。年龄30岁～59岁,平均年龄41岁。其中高分化鳞癌22例,低分化鳞癌18例。
1.2 研究方法
宫颈标本均经10%的甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚4 μm~5 μm，载玻片经多聚赖氨酸处理，防止脱片;微波抗原修复。兔抗人Caspase?3多克隆抗体，兔抗人Survivin多克隆抗体，兔抗人p63多克隆抗体，兔抗人bak多克隆抗体，免疫组化试剂盒、DAB显色剂试剂盒均购自福州迈新公司。染色步骤按试剂盒说明书操作。PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明，树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。光镜下任取4个高倍视野进行细胞计数，至少计数200个细胞，免疫组化染色阳性为棕黄色颗粒定位于细胞浆或细胞核,阳性细胞数为0 记做(-),阳性细胞数占肿瘤细胞总数25%以下为(+),25%～50%为(++),>50%为(+++)。
1.3 统计方法
使用Stata 4.0统计软件，采用χ2检验，P＜0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 Survivin、Caspase?3、p63、bak蛋白在宫颈鳞癌和正常宫颈组织中表达
Survivin 蛋白阳性表达呈棕黄色,颗粒状,主要定位于肿瘤细胞胞浆中,偶见于胞核。Caspase?3蛋白阳性表达呈棕黄色,颗粒状，主要定位于细胞浆中,少数定位于细胞核中。p63蛋白阳性表达呈棕黄色,颗粒状,主要定位于细胞核。bak蛋白阳性表达呈棕黄色,颗粒状，主要定位于细胞浆及核膜。40例宫颈癌及10例正常宫颈组织中的表达情况见表1。表1 Survivin、Caspase?3、p63、bak在宫颈鳞癌和正常宫颈组织中表达（略）注：P<0.05。
表1显示：宫颈鳞癌中Survivin蛋白表达较正常宫颈组织明显升高，差异有显著性（P<0.05）。Caspase?3蛋白表达较正常宫颈组织明显降低，差异有显著性（P<0.05）。p63蛋白表达较正常宫颈组织明显升高，差异有显著性（P<0.05）。bak蛋白表达较正常宫颈组织明显降低，差异有显著性（P<0.05）。
2.2 Survivin、Caspase?3、p63、bak蛋白在宫颈鳞癌中的表达
随着肿瘤分化程度的降低，Survivin蛋白的阳性表达明显升高，Caspase?3蛋白的阳性表达明显降低，p63蛋白的阳性表达明显升高，bak蛋白的阳性表达明显降低，差异均有显著意义（P<0.05），见表2。表2 Survivin、Caspase?3p、p63、bak与宫颈鳞癌病理分级的关系（略）注：P<0.05。
表2显示：随着肿瘤分化程度的降低，Survivin蛋白的阳性表达升高，差异有显著性（P<0.05）。Caspase?3蛋白的阳性表达降低，差异有显著性（P<0.05）。p63蛋白的阳性表达升高，差异有显著性（P<0.05）。bak蛋白的阳性表达降低，差异有显著性（P<0.05）。
3 讨论
Survivin基因是一类结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白［1］,在调控细胞周期和抑制细胞凋亡中起重要作用,通过直接阻断Caspase?3和Caspase?7的效应,从而抑制细胞凋亡,有利于细胞的异常增殖和恶性转化,是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin基因在正常组织中不表达或低表达,而在几乎所有被研究的肿瘤组织中呈高表达［2］,这一特点使其可能成为判断肿瘤患者预后及辅助肿瘤诊断的一项重要指标,也为肿瘤的诊断和提供了新的靶点。
本研究结果显示,Survivin蛋白定位于细胞浆和胞核,在宫颈鳞癌中呈高表达，而在正常宫颈组织中无阳性表达（P<0.05）。显示Survivin基因在宫颈鳞癌中表达上调,细胞生长和凋亡途径的紊乱，则有利于肿瘤的生长和侵袭。宫颈癌组织中Survivin基因的异常表达，可能直接促进细胞逃离正常的监控机制,即通过抑制恶性细胞凋亡,促进细胞异常增殖,参与宫颈鳞癌的发生、发展,因此Survivin是一个有潜在价值的肿瘤标志物。本研究结果同时显示，肿瘤分化程度越低,其阳性表达率愈高,提示在Survivin蛋白在肿瘤细胞中的表达越高，对癌细胞凋亡抑制能力越强，癌细胞的生存能力和肿瘤的恶性程度也随之增高，癌细胞更容易侵袭周围组织并发生转移，导致患者的生存期缩短，即Survivin蛋白的高表达预示宫颈鳞癌患者预后不良。
由于Survivin蛋白在宫颈鳞癌的生长过程中发挥了重要作用，故Survivin蛋白的表达可以作为预后不良的重要指标，也可能成为宫颈鳞癌的一个新靶点。设法阻断Survivin蛋白的表达，可能会发挥抑制宫颈鳞癌细胞生长的作用，从而促进肿瘤细胞的凋亡,将有利于肿瘤的治疗,使得应用蛋白特异性抗体免疫治疗以及反义基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性，为宫颈鳞癌的治疗提供了新的思路。
细胞凋亡是一种基因控制的细胞主动死亡过程,正常组织的细胞处于不断增殖和不断凋亡的动态平衡状态中,一旦细胞调节紊乱,两者失衡,则可发生肿瘤。凋亡抑制蛋白阻断细胞凋亡的途径,是通过直接作用于细胞凋亡途中的终末效应酶—半胱氨酸蛋白酶caspase?3、caspase?7起作用的,而caspase是细胞凋亡的核心,一旦caspase功能受到抑制,DNA 受损,细胞则会无限增殖,继而形成肿瘤。
Caspase?3是Caspase家族中的最重的成员［3］，是细胞凋亡过程中的主要效应因子［4］。Caspase?3可通过Fas介导的死亡信号途径,被Caspase家族上游成员激活并水解为活性酶形式,进而裂解细胞的关键结构蛋白和看家蛋白,导致细胞凋亡［5］。本研究结果显示, Caspase?3在正常宫颈中为高表达,在宫颈癌组织中的阳性表达率明显低于在正常宫颈组织，(P<0.05) 。随着宫颈鳞癌分化程度的降低，Caspase?3蛋白的阳性表达降低，差异有显著性（P<0.05）。提示Caspase?3在正常宫颈组织中表达加强，可促进异常增生细胞凋亡，进而拮抗细胞的增殖,维持细胞数目的稳定。但是随着癌变的发生，细胞增殖速度的增加,异常增生的细胞中绝对凋亡率开始降低。随着癌肿分化程度的逐步降低，Caspase?3的表达强度明显逐步减弱。可能是此期Caspase?3的生物合成已受到某些因素影响,再不能正常发挥促进细胞凋亡的作用。由于Caspase?3表达强度在高分化组明显高于低分化组,提示癌细胞分化程度高,细胞凋亡调控机制障碍程度轻,癌细胞增殖较弱,患者预后较好。
p63基因是1998年Yang等在人类及大鼠基因组中发现的一个与p53同源的基因家族新成员,正常主要表达于许多上皮组织的基底层,对各上皮和间叶组织正常发生、分化以及形态学的发生具有重要作用［6］,p63基因在肿瘤中的高表达,可以抑制野生型p53的活性,阻止野生型p53诱导的细胞凋亡,以促进肿瘤的生长和。近年来研究发现,p63主要表达鳞状上皮起源的肿瘤组织中,且随着分化程度的升高而减低,被认为可能与某种程度的鳞状上皮相关性基因的表达潜能有关［7］。本研究结果显示,p63蛋白定位于细胞核，在正常宫颈组织中呈低表达，而在宫颈鳞癌的表达明显增加，说明p63具有调节宫颈鳞癌增殖与分化的作用。本研究结果同时显示，肿瘤分化程度越低,p63蛋白阳性表达率愈高,提示在肿瘤组织中的p63蛋白能够抑制正常的细胞凋亡过程，p63蛋白在肿瘤细胞中的表达越高，其对癌细胞凋亡抑制能力越强，癌细胞的生存能力和肿瘤的恶性程度也随之增高,可作为判断患者预后的可靠指标。
近年来对细胞凋亡的研究主要集中于细胞凋亡的相关基因，而Bcl?2基因家族是其中的典型代表。bak是Bcl?2家族中又一促凋亡基因，它编码一个由216个氨基酸组成的蛋白质，与Bcl?2蛋白有28%的同源性，与bcl?xl结合后影响其下游的信号传导，从而中和bcl?xl的抑制凋亡作用。也能不依赖与bcl?xl形成异二聚体的作用而独自发挥促凋亡的作用［8］。本研究结果显示，bak在宫颈鳞癌中表达较正常宫颈组织中明显减少，尤以低分化鳞癌更明显，可见bak基因表达下调与宫颈鳞癌的发生密切相关。由于bak基因表达减少，正常细胞的凋亡受到抑制，使鳞状细胞寿命延长，凋亡减少，从而促使肿瘤的发生。在高分化鳞癌中，由于细胞分化较好，鳞癌细胞较成熟，此时bak还能够发挥部分作用，促进肿瘤细胞凋亡，达到限制肿瘤生长的目的。而低分化宫颈鳞癌细胞由于分化较差，癌细胞多处于不成熟状态，bak表达较少且无法发挥其功能，所以肿瘤细胞失去抑制，具有旺盛的生命力，不断增殖并向周围浸润。提示bak蛋白表达能够促进细胞凋亡，进而在一定程度上阻止宫颈鳞癌进展，对防止癌细胞转移、扩散具有积极意义。
宫颈癌的发生如同其他的恶性肿瘤一样,是多基因调控的复杂过程。Survivin 及Caspase?3基因蛋白在宫颈鳞癌组织中的再激活和异常表达，对宫颈鳞癌的诊断及预后具有重要参考价值,针对Survivin的靶向联合治疗可能为成为宫颈癌的有效治疗方法之一。凋亡调控基因p63、bak都参与了宫颈鳞癌的形成和发展，因此，有效地控制细胞的增殖与凋亡，对宫颈鳞癌治疗有重要的研究价值，可为宫颈鳞癌的治疗提供新的思路。联合检Survivin、Caspase?3、p63、bak基因蛋白在评估宫颈鳞癌的发生、发展及估计预后方面均具有重要意义。
【参考】
［1］Shin S,Sung BJ,Cho YS,et al.Antiapoptotic protein human is a director inhibitor of caspase?3 and?7［J］.Biochemiistry,2001,40(4):1117?1123.
［2］Altieri,Dario C.versatile modulation of cell di2 vision and apoptosis in cancer［J］.Oncogene,2003,22(53):8581?8589.
［3］Worf BB,Green DR.Suicidal Tendencies :Apoptotic cell Death by Caspase Farnily Proteinase［J］.J Biol Chem,1999,274(29):20049?20052.
［4］袁长青,丁振华.Caspase的活化及在细胞凋亡之中的作用［J］.生理进展,2002,22(2):220.
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［8］Simonian P,Grillot D,Nunez G.Bak can accelerate chemotherapy induced cell death independently of its heterodimerization With BCl?xl and BCl?2［J］.Oncogene,1997，15：1871?1875.
