钒酸盐氧化法测定血清胆红素的分析评价
【摘要】 目的：对测定胆红素的钒酸盐氧化法进行分析评价。方法：用钒酸盐氧化法测定胆红素，并对其的精密度、稳定性、灵敏度及干扰因素进行分析。结果：钒酸盐氧化法测定胆红素的批内、批间CV<3.25%，可信检测范围可达:钒酸盐总胆红素(TBil)684 μmol/L,直接胆红素(DBil)342 μmol/L，回收率达到98.1%～102.4%。用1∶8肝素抗凝，测定直接胆红素明显降低，P<0.01；1∶10肝素抗凝，测定直接胆红素，有轻度的负干扰。维生素C≤0.05 g/L时，无干扰，而溶血及脂质对钒酸盐氧化法干扰小。结论：钒酸盐氧化法应用方便，重复性好，灵敏度高，抗干扰性强。
【关键词】 胆红素；钒酸盐氧化法；肝素抗凝
1993年日本学者Tokuda发表了血清胆红素的钒酸盐氧化测定法。随着商品化钒酸盐胆红素氧化法试剂的推广，目前国内用户众多［1］。本文对其精密度、稳定性、灵敏度及干扰因素进行评价和分析。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器
1.1.1 试剂 钒酸盐总胆红素（TBil）试剂盒、直接胆红素（DBil）试剂盒由东瓯生物工程有限公司提供，临床用20%英脱利匹特脂肪乳由华瑞制药有限公司提供，维生素C由湖北中天爱白药业有限公司提供，12 500 U/2 ml肝素注射液由天津市生物化学制药厂提供。血红蛋白液的制备：取1份约3 ml肝素钠抗凝血，反复加入生理盐水洗涤，最后加入蒸馏水离心取上清液，用KX?21N血细胞分析仪测Hb为100 g/L。
1.1.2 仪器 日立7060全自动生化分析仪，Sysmex KX?21N血细胞分析仪。
1.1.3 统计学处理 计量资料数据以±s表示，采用配对t检验。P<0.05具有统计学意义，使用SPSS 10.0软件进行统计分析。
1.2 测定原理 在pH 3附近，表面活性剂和钒酸作用于血清TBil，使之氧化成胆绿素，使胆红素所特有的黄色减少，由此测定钒酸作用前后450 nm吸光度的变化求出血清中TBil的浓度。在pH 3附近，当试剂中缺少表面活性剂时，钒酸只与血清中结合胆红素作用，使之氧化成胆绿素，此时测定450 nm吸光度下降值求出血清中DBil的浓度。
1.3 主要测定参数 在日立7060型全自动生化分析仪商用钒酸盐氧化法测定血清胆红素主要参数如下:波长450/546 nm；温度37°；方法为二点终点法。试剂Ⅰ280 μl，样本10 μl, 反应5 min,读取第1点吸光度；然后加入试剂Ⅱ 70 μl，再反应5 min,读取第2点吸光度。
2 结果
2.1 精密度 用一中值质控物，连续测定20次，再每天测1次，共20 d，结果见表1。
表1 钒酸盐法测定胆红素的精密度（略）
从表1可以看出，钒酸盐测定胆红素，批内及批间都有良好的重复性。
2.2 线性范围 取TBil为5.8 μmol/L，DBil为1.2 μmol/L的低值血清对TBil为684 μmol/L、DBil为342 μmol/L的患者高值血清分别按1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5的比例稀释，用钒酸盐法测定每份标本的TBil及DBil含量，各浓度均重复测定4次，观察其线性，结果表明TBil在684 μmol/L内、DBil在342 μmol/L内仍保持良好的直线关系。
2.3 回收试验 在0.9 ml TBil浓度为20.90 μmol/L，DBil浓度为5.90 μmol/L的血清标本中加入0.1 ml胆红素标准液。胆红素标准液浓度：高值TBil为255.60 μmol/L，DBil为19.40 μmol/L；中值TBil为148.68 μmol/L，DBil为48.16 μmol/L；低值TBil为72.82 μmol/L，DBil为24.46 μmol/L。测定标本中TBil、DBil浓度。钒酸盐氧化法测定TBil的回收率分别为101.59%、99.3%、98.9%，平均回收率为99.93%；DBil回收率分别为102.4%、98.3%、98.1%，平均回收率为99.6%。
3 干扰试验
3.1 肝素干扰试验 将新鲜血液分别加入预先备制好的无肝素液、1∶8肝素抗凝液、1∶10肝素抗凝液、1∶12肝素抗凝液20 μl（每毫升血液加入量），使每毫升含肝素0 U、15.6 U、12.5 U、10.4 U，测定TBil、DBil。结果用1∶8肝素抗凝，测定DBil明显降低，P<0.01；1∶10肝素抗凝，测定DBil，有轻度的负干扰，见表2。
表2 肝素对胆红素测定的影响（略）
注：*示比较差异有显著性，P<0.01，平均偏差：（2）、（3）、（4）组测定结果与（1）组之差。
3.2 溶血干扰试验 将已知值的100 g/L血红蛋白样品，作0，1/2，1/4，1/8，1/16稀释后， 分别按1∶9加入高低两个水平临床新鲜血清中进行分析，检测TBil、DBil。结果Hb≤10 g/L时对TBil无影响，对DBil有轻度负干扰。Hb≤5 g/L时对DBil无影响，见表3。
表3 溶血对胆红素测定的影响（略）
3.3 脂血干扰试验 分别取0%～5%的脂肪乳0.1 ml加入0.9 ml混合血清，在高低两个水平临床新鲜血清中测定TBil、DBil。 结果5%以下的脂质对TBil测定无影响，对DBil测定基本无影响，见表4。
表4 脂质对胆红素测定的影响（略）
3.4 维生素C干扰试验 将维生素C 1.000 g/L作0，1/2，1/4，1/8，1/16倍比稀释后，再分别按1∶9加入高低两个水平临床新鲜血清中测定TBil、DBil。结果在血清中维生素C≤0.050 g/L时，对测定物无影响，见表5。
表5 维生素C对胆红素测定的影响（略）
4 相关试验
随机抽取60份患者标本分别用钒酸氧化法（Y）和重氮法（X）测定其血清胆红素，用SPSS软件包进行相关性分析比较：TBil（μmol/L）Y=0.854 X+1.01，r=0.985；DBil（μmol/L）Y=0.991 X+1.56，r=0.991。
5 讨论
胆红素测定应用最广泛的化学测定方法是根据Ehrlich在1883年建立的重氮反应方法，但其影响因素多，尤其溶血、脂血对其影响更大，且需在使用时临时配制试剂，比较麻烦［2］。氧化酶法受溶血影响较大，而钒酸盐法弥补了这些缺点，它具有抗溶血、抗黄疸、抗脂血等优点，能够测定TBil和DBil；同时该试剂具有良好的稳定性，试剂开瓶稳定性极佳，TBil试剂可室温存放。我们对此法进行了系统评价。试验结果表明，此法具有较好的精密度，在批内、批间CV<3.25%，可信检测范围可达:TBil 684 μmol/L, DBil 342 μmol/L，回收率达到98.1%～102.4%。抗Hb能力和脂血干扰能力强，即使当Hb达5 g/L时，对钒酸盐法仍无干扰。该干扰因素是溶血引起的重氮法测定胆红素误差的主要原因，另一原因是血红蛋与重氮试剂反应形成的产物可以破坏偶氮胆红素［3］。据报道称维生素C对钒酸盐法无干扰［4］，而我们的实验结果是：当维生素C≤0.5 g/L时，对此方法无干扰，当维生素C>0.5 g/L时，导致结果偏低，原因可能是维生素C的还原性所至。试验结果还显示：1∶8肝素抗凝组即每毫升血含15.6 U肝素抗凝管与血清比较，TBil结果稍低，经统计学处理无显著意，DBil明显降低（P<0.01）。1∶10肝素抗凝组即含12.5 U/ml的肝素抗凝管与血清比较，DBil偏低，有轻度的负干扰。临床上应用肝素抗凝常用量为：1 mg（25 U）肝素抗凝5 ml～10 ml全血。按最小用量12.5 U肝素抗凝1 ml全血，此浓度对TBil和DBil都有轻度的负干扰，而高于此浓度，则对DBil有明显的负干扰。因此，在应用肝素抗凝血浆胆红素时，应严格控制肝素与全血的比例。综上所述，钒酸盐法在抗干扰方面强，在准确、灵活、特异性方面明显优于其他法，且无需临时配制，减少人为误差，适用作为实验室的常规方法。
【】
［1］ 叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.第3版.南京：东南大学出版社，2006：456?457.
［2］ 王琏文，高恩钰.五种不同血清总胆红素测定方法筛选和推荐改良J?G法的实验报告［J］.中华检验医学检验杂志，2002，5(1)：25.
［3］ 邱谷.溶血对重氮法血清胆红素测定的干扰分析［J］.上海医学检验杂志，2003，15：350?356.
［4］ 马荣红，王晖，秦锦屏.钒酸盐氧化法测定血清总胆红素、直接胆红素的方法评价［J］.江西医学检验，2002，20：93?94.
