病理基因测序技术及临床应用
【摘要】 目的：应用基因测序仪对肿瘤及相关疾病进行临床病理基因直接测序，以指导医疗保健、疾病预防、基因。方法：石蜡组织、血液标本提取DNA，经凝胶成像及核酸定量仪定量、定性，设计相应的引物及购买测序试剂盒，经PCR扩增后进行基因测序，通过Seq?Scap软件诊断分析测序结果，并对阳性结果做反向测序证实。结果：石蜡组织标本DNA提取成功率80％，总提取成功率90％以上，在此基础上的PCR扩增、纯化及测序成功率达99％。测序基线平整，平均信号强度在200~1 000之间，噪音<５，Raw基线接近0。预报分子靶向药物治疗有效率及无效率均达100％。结论：临床病理基因测序是癌症基因组计划的核心内容，基因测序技术可以快速准确地完成肿瘤基因序列分析，该技术重复率高、结果可靠、性强，是分子病的一个重要新领域。
【关键词】 基因测序；癌症基因组；Seq?Scap软件
随着分子生物学技术的不断发展，基因诊断已受到广泛关注。我院2004年引进美国ABI 3100?Avant遗传分析仪及Seq?Scap测序诊断软件，根据Gene Bank基因序列选择WHO Pathology＆Genetics列出的与疾病有重要意义的基因及其片段，使用测序仪测定靶基因的核苷酸序列，应用Seq?Scap软件自动诊断临床病理标本。目前对肿瘤、癌前病变和心脑血管等多种疾病全面开展P53全基因组、K?ras 基因、BRCA1全基因组、C?kit基因、EGFR基因、APC基因、YMDD乙肝病毒耐药基因和APOE基因多态性序列分析，并开始尝试与美国癌症基因组（TCGA）计划接轨。
1 材料与方法
1.1 材料 所有材料均为临床快速冰冻送检组织、甲醛固定组织和心脑血管疾病及健康体检人群血液标本计890例，对照组织为非肿瘤切端或血液标本210例。
1.2 主要仪器与试剂 美国ABI 3100?Avant Genetic Analyzer 遗传分析仪、ABI GeneAmp PCR System 2700、Promega公司A1120 基因组DNA提取试剂盒、Qiagen公司HotStarTaq DNA Polymerase 及ABI BigDye Terminator v3.1 Kit 测序试剂盒(Part .No 4336917)。
1.3 方法
1.3.1 引物设计 根据NCBI和WHO相关选择临床意义明确的候选目的基因，使用Oligo软件设计引物，由上海生物工程公司合成。其中，APOE基因引物特异性扩增其第4外显子区含编码112位与158位氨基酸序列，产物片段358 bp。K?ras基因引物扩增其第1外显子区，产物片段397 bp。EGFR基因第18、19、21外显子，产物片段分别为437、411、399 bp。C?kit基因第11外显子的产物片段378 bp、乙肝耐药基因（YMDD）产物片段338 bp等。
1.3.2 基因组DNA提取及PCR扩增条件的建立 取受检对象静脉血2 ml，肝素抗凝处理，按说明书提取DNA，-18℃保存备用。20 μl PCR反应体系：10 PCR Buffer（含15 mM MgCl2）2 μl，HotStarTaq DNA Polymerase 0.2 μl，5Q?Solution 4 μl，dNTP mix(10 m M of each)2 μl，上下游引物各1 μl，模板 DNA 1 μl，Distilled water 8.8 μl。PCR反应条件：95℃预变性15 min，用Touchdown PCR技术，94℃变性50 sec，63℃~58℃退火1 min（-0.5℃/min），72℃延伸1 min，共循环10次；94℃变性50 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。
1.3.3 PCR产物纯化及测序 用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，用V?gene公司PCR产物纯化试剂盒，过柱纯化后进行测序反应。10 μl测序反应体系：1 μl BigDye+1.5 μl BigDye Sequencing Buffer＋3 μl上游引物+1 μl PCR纯化产物+3.5 μl ddH2O。 测序PCR热循环条件：96℃，10 s→ (96℃ 10 s→50℃ 5 s→60℃ 4 min)×25个循环→60℃，4 min→4℃保温。测序反应产物纯化后（酒精/NaAc法），经95℃变性4 min，迅速置冰水中冷却4 min，上样至ABI 3100?Avant遗传分析仪进行毛细管电泳，在Datecollection 2.0软件下运行并获取结果。
1.3.4 Seq?Scap软件自动诊断分析 将测序结果用DNA sequencing analysis 5.1软件自动分析原始测序数据，获取测序电泳图和序列图，然后进入Seq?Scap软件自动诊断程序。
图1 APOE基因E4/3基因型（略）
图2 P53基因C/T杂合突变（略）
图3 EGFR基因（略）
2 结果与讨论
石蜡组织标本DNA提取成功率80％，总提取成功率90％以上，在此基础上的PCR扩增、纯化及测序成功率达99％。测序基线平整，平均信号强度在200~1 000之间，噪音<５，Raw基线接近0。预报分子靶向药物有效率及无效率均达100％。
3 讨论
医学基因测序又称为再测序（Re?sequencing），基于分子病理的医学基因测序在医疗机构中的实验室建设尚十分薄弱，其原因之一在于临床病理基因诊断的操作技术复杂、知识基础不足。目前，美国癌症基因组计划已涉及到癌症的全基因组突变、病理形态类型的基因标记分类、癌症的病理基因检测指导治疗。美国ABI 所属的Celera公司目前已生产了3万多种不同的医学基因测序诊断试剂盒及与其相匹配的全基因组软件—Seq?Scap V2.0及相关SOP ，可在很大程度上自动、准确地完成数万种不同类型的基因测序、突变检测。临床基因测序检测对病理科的形态诊断金标准含金量的提升和分子病理技术的开发及效益改善有现实意义。2年多来，我们完成了十多种病理基因测序及片段分析共1 100例的检测，体会如下：组织和血液DNA抽提成功率100％，石蜡标本首次抽提成功率80％，关键环节在于选用DNA抽提试剂盒，用中性甲醛固定时间<48 h，充分洗脱甲醛且消化彻底；结果显示基线平整，各碱基平均信号强度（Ave Signal Intensity）在200~1 000之间，噪音（Noise）<５，Raw基线接近0［1］。（基因测序结果如图1~3）；测序质量控制要点：模板DNA质量要高；PCR要求条带单一，但拷贝量要求不高；PCR产物一定要经过纯化处理，测序反应后推荐用酒精/NaAc法再纯化；电泳毛细管需定期养护和灌胶；通过检测肿瘤及相关基因的序列，出开展基因测序项目在病理外检中有如下几点临床应用意义：对于可疑癌前病变患者可以明确其病变标本是否真正含有候选基因的突变，以解除大量由免疫组化标记癌基因阳性患者的心理恐慌和经济负担［2］。对病理切片平面局部未能反映的淋巴结转移，通过全淋巴结组织DNA溶胶K?RAS癌基因测序，辅助检测临床微转移现象。鉴定心脑血管疾病APOE基因多态性6种基因表型，ε4高危类型与高脂血症、冠心病、脑血管病和老年性痴呆有关。对癌症家族有血缘关系的亲属检测相关癌基因突变或多态性，具有亚健康诊断和体检意义。对肿瘤分子靶向药物治疗检测C?kit［3］和EGFR 18、19、21外显子突变具有癌症治疗的积极意义［4~7］。YMDD突变检测乙肝病毒对拉米呋定的耐药性。
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