原位细胞凋亡检测改良方法的比较
【摘要】 目的:探讨TUNEL法检测细胞凋亡的最佳条件。方法:利用9例标本45张组织切片进行凋亡检测，分别单纯和组合使用蛋白酶K消化、微波修复和Triton X?100前处理方法并作比较。结果:蛋白酶K合并微波及Triton X?100组（+ +）阳性率为89%，蛋白酶K合并微波组（++）阳性率为67%， 蛋白酶K合并Triton X?100组（+ +）阳性率为44%，单纯蛋白酶K 及微波组（++）阳性率均为11%。将组合处理组与单纯处理组比较，P<0.01，差异有显著性。结论:蛋白酶K消化、微波及Triton X?100多重组合的检测前处理方法可以明显提高杂交信号阳性敏感度。
【关键词】 细胞凋亡；蛋白酶K；微波
细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡，是一种受基因控制的主动性细胞自杀过程，肿瘤的发生、和转归都与细胞凋亡有密切的关系［1］。原位凋亡检测是近些年发展起来的细胞凋亡检测技术，目前广泛采用的是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术。凋亡率的高低与患者预后也有着直接的关系，现已成为评价疗效的重要指标之一［2］。本文应用蛋白酶K消化、微波、和Triton X?100不同的前处理方法，进行凋亡检测的改良和比较，以提高检测阳性率，正确反映机体细胞凋亡的实际水平。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及设备 Roche公司生产的AP?原位细胞凋亡检测试剂盒（Cat.NO. 11684809910）；微波炉（ywy 781医用型）。 所用载玻片均用清洁液浸泡24 h以上，自来水、蒸馏水冲洗，95%酒精浸泡擦干，以APES?丙酮防脱片处理备用。
1.2 实验分组 选取组织标本9例，包括慢性胃炎3例，胃癌3例，食管癌3例，经10%中性甲醛固定24 h，石蜡包埋后每例标本均连续切片6张，厚度4 μm，HE染色一张，余作凋亡染色。设计蛋白酶K组、微波处理组、蛋白酶合并微波组、蛋白酶合并Triton X?100组、蛋白酶合并微波及Triton X?100组，每组设阴性对照2张。
1.3 方法
1.3.1 前处理 组织切片脱蜡至水，蒸馏水洗。蛋白酶K组：滴加PBS稀释的蛋白酶K（20 μg/ml），37 ℃孵育20 min，PBS冲洗终止反应。微波组：将切片置于200 ml 0.01 M pH 6.0枸橼酸缓冲液中微波处理8 min, 370 W，温度达98 ℃维持20 min后冷却。 蛋白酶+微波组：蛋白酶K消化20 min，终止反应后再同微波组处理。蛋白酶K+ Triton X?100组：蛋白酶K消化切片后以PBS冲洗，再以0.1% Triton X?100室温下孵育8 min。蛋白酶+微波+Triton X?100组：依次操作同前。
1.3.2 标记 组织切片经上述处理后，按试剂说明书将末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)与荧光素连接的核苷酸混合配制成TUNEL反应液，每片滴加30 μl～50 μl，阴性对照以PBS代替，37 ℃，60 min，0.01 M pH 7.4 PBS缓冲液漂洗3次，再滴加碱性磷酸酶（AKP）标记的抗荧光素抗体，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，NBT/BCIP避光显色约10 min，镜下观察，适时终止反应，晾干后用水溶性胶（AEC?GLY）封片。
1.3.3 结果判定 以细胞核阳性为判定标准，并结合HE染色，对HE染色证实为坏死的细胞不记数。在相同组织切片5个高倍视野记数各组间阳性细胞百分比，凋亡细胞阳性率<5%为(-),5%～25%(+),25%～50%(+ +),>50%(+++)。
1.3.4 统计处理 计数资料用百分比表示,数据的统计及分析使用SPSS 12. 0统计软件。
2 结果
凋亡阳性细胞核呈深紫褐色，阴性细胞核不着色（见图1～图4）。各组切片比较，以蛋白酶K合并微波处理及Triton X?100组阳性敏感度最高，蛋白酶K合并微波组次之，单纯蛋白酶K及微波组最低。各组阳性细胞敏感度百分比见表1，差异有显著性意义（P<0.01）。
表1 不同的前处理方法凋亡检测阳性敏感度比较（略）
注：A组与B组或C组比较，P<0.01。
图1 A组AP?TUNEL200（略）
图2 B组AP?TUNEL200（略）
图3 C组AP?TUNEL200（略）
图4 D组AP?TUNEL200（略）
3 讨论
TUNEL技术作为一种比较成熟的凋亡细胞染色方法已被广泛采用,但如何提高染色的特异性和敏感性还存在一些问题。应用TUNEL法检测细胞凋亡时，染色的结果常常受到多因素的影响,如组织的自溶、固定剂的类型、固定包埋时造成的DNA损伤,染色过程中试剂的浓度、作用的时间等均是影响染色成败的关键。 目前的凋亡检测多采用蛋白酶K或胰蛋白酶等单一的前处理方法，对于石蜡标本的染色阳性度和敏感度普遍不高,容易出现假阳性和假阴性,因此，在进行组织切片的原位检测时，对组织切片进行预处理是必要的［3］，可以提高该方法的敏感性和消除假阳性及非特异性染色，但试剂说明及均未肯定哪一种方法更好。有研究表明，TUNEL染色时蛋白酶K的作用可能引起内源性核酸内切酶的释放，造成假阳性反应。因此，操作时应注意蛋白酶K的浓度及作用时间，消化时间太长，非特异性染色增多，破坏细胞形态，背景不清晰，而消化时间太短，细胞膜达不到应有的通透性，影响标记效果，同时，微波处理组织切片已广泛用于免疫组织化学的抗原修复,在0.01 M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中经一定温度的微波处理可修复因固定和包埋造成的抗原破坏,打断氨基酸的肽键结合,促进抗原决定族的暴露,恢复细胞膜的空间结构,并且增加穿透效应,加速组织处理及染色过程［5］。本实验借鉴免疫组化方法，将微波修复应用于凋亡检测，并增加Triton X?100步骤，旨在进一步提高细胞核的穿透性。本研究将三种不同的染色前处理方法分别组合并进行凋亡检测比较，结果显示，单一的前处理方法没有显著差别，均不能明显提高杂交信号的阳性敏感度，而蛋白酶K合并微波及Triton X?100组TUNEL阳性细胞大多为凋亡的细胞,且阳性率大大高于单一前处理组。综上所述，我们认为：单一的蛋白酶K消化等凋亡检测前处理对提高杂交阳性信号差异不大；以蛋白酶K、微波修复及Triton X?100的前处理组合不失为提高阳性敏感度一个有效的方法，特别适用于甲醛固定、石蜡包埋的难处理组织；多重的前处理组合程序要求所用载玻片严格清洁并作APES涂胶处理。
【文献】
［1］ Kerr JF, Winterford CM, Harmon BV.Apoptosis, its significance in cancer and cancer therapy［J］.Cancer,1994,73:2013?2202.
［2］ Kong J, Ringer DP.Quantitative In Situ image analysis of apoptosis in well and poorly differentiated tumors from rat liver［J］.Am J Pathol,1995,147:1626.
［3］ Negoescu A, Lorimier P, Labat Moleur F, et al.In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method : improvement and evaluation on cell preparations［J］.J Histochem Cytochem,1996,44:959?968.
［4］ Stahelin BJ, Marti U, Solioz M, et al.False positive staining in TUNEL assay is due to release of endogenousDnase and inhibited by diethy1?pyrocarbonate (DEPC) in liver tissue［J］. Hepatology,1996,4:268.
［5］ Shi SR, Cote RJ, Young LL, et al. Antigen retrieval immunohistochemistry: practice and development［J］. J Histotechnol,1997,20:145?150.
