伤寒杆菌实验室诊断研究进展
【关键词】 伤寒杆菌；检测方法；实验室诊断
伤寒是由伤寒杆菌引起的肠道传染病，除引起肠道病变外，还能导致其他器官或全身感染，严重威胁人民的健康。伤寒杆菌的诊断依据主要为临床症状及实验室诊断。肥达试验和细菌培养是诊断伤寒杆菌的传统方法，但敏感性低且费时。近年来出现的免疫学检测方法和聚合酶链反应技术具有较高的特异性和敏感性，且操作简单、快速。本文就伤寒杆菌实验室诊断方法综述如下。
1 细菌培养
培养是最常用确诊伤寒的诊断依据，由于特异性高，不出现假阳性而被称为金标准。血液和骨髓穿剌液先用亚硒酸盐胱氨酸增菌液进行增菌培养，粪、尿可直接接种于SS培养基，经历37℃ 24 h培养后从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，首先进行革兰染色镜检，镜下为革兰染色阴性，呈短杆状，无芽胞，无荚膜。挑选可疑菌落，接种双糖铁，作血清学鉴定为沙门菌属D组后，进一步作生化反应，即伤寒杆菌不分解乳糖、蔗糖及鼠李糖，能分解葡萄糖，产酸不产气，赖氨酸脱羧酶阳性，谷氨酸脱羧酶阴性，甲基红试验阳性。副伤寒杆菌形态与伤寒杆菌相似，能分解葡萄糖，产酸产气。临床上伤寒患者在体温上升阶段，在抗生素应用之前作血培养，阳性率可在80%以上，在发病第2周、第3周，粪便培养阳性率可达到60%。培养结果容易受抗生素、培养条件、标本采集的质、量和时间等多因素影响，带菌者检出率较低，结果报告也常需3 d～5 d的时间。
2 血清学反应
肥达试验是常用于辅助诊断伤寒的传统方法。其原理是用伤寒杆菌的菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原以及副伤寒甲、乙、丙菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判断血清中有无伤寒杆菌的抗体。伤寒病发作后，约在第5天出现O抗体，第10天～第12天产生H抗体。早期肥达试验需要急性期和大约间隔10天的康复期血清，两份标本之间抗O抗体或抗H抗体滴度升高4倍，更有诊断意义。伤寒杆菌的 O抗原与A群、B群沙门氏菌有部分相同抗原，与甲、乙两种副伤寒杆菌有一定的交叉反应，因此，肥达反应诊断伤寒杆菌常出现假阳性，特异性差，敏感性低，而且抗原抗体结合出现凝集沉淀常需要20 h以上。
3 免疫学方法
3.1 酶联免疫吸咐试验(ELISA) 根据抗原或抗体特异性免疫反应原理设计，将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上，以辣根过氧化酶为指示剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗原。
3.1.1 双抗体夹心ELISA法 检测的是血清中的伤寒杆菌或伤寒杆菌抗原。其原理是：用于包被的抗体和酶标记的抗体是针对伤寒杆菌鞭毛抗原（H抗原）的单克隆抗体。与甲、乙、丙型副伤寒杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等无交叉反应，但伤寒杆菌H抗原仅有的第一相（d），与斯坦利等一些罕见的沙门氏菌有相同的相位，斯坦利菌虽然不引起类似伤寒的疾病，但可使结果出现假阳性；据报道有少数健康人血清也能使双抗体夹心法的结果呈阳性［1］。因此，ELISA法特异性有一定的局限性，阳性结果表明有伤寒杆菌或伤寒抗原存在的可能性，但此法敏感性高，阴性结果可靠。该方法操作简便,约40 min即能报告结果，具有早期诊断价值，适用于疾病预防部门对从业人员定期检测伤寒杆菌带菌者，追踪传染源，在流行病学上有重要意义。
3.1.2 斑点酶联免疫吸附试验（Dot?ELISA） Dot?ELISA的基本原理是双抗原夹心法。伤寒杆菌的脂多糖（LPS）即O抗原能剌激机体产生IgM抗体，H抗原能刺激机体产生IgG抗体。通过检测患者血清中的IgM、IgG抗体，即可知道是否感染了伤寒杆菌。Cardona?Castro［2］等以硝酸纤维素膜为载体，用伤寒杆菌的IgG、IgM抗原包被，利用微孔滤膜的可过滤性使抗原抗体发生反应，建立Dot?ELISA试验。对102例伤寒患者在发病不同的时间段进行检测，结果显示，IgG抗体的敏感性和和特异性分别为88%和88%，IgM抗体的敏感性和特异性分别为12.1%和97%。Khan［3］等用Dot?ELISA法对128例疑似伤寒患者进行检测，以骨髓培养为金标准，Dot?ELISA法的敏感性和特异性分别为71%和43%。文献报道Dot?ELISA法的敏感性和特异性的差异较大，可能与研究者研究的对象和IgM、IgG抗体在患者体内产生的时间有关。
3.2 浸染试验（Dipstick assay） 又称快速试纸法。Dipstick是近年起来的一种用胶体金作指示剂的快速诊断方法。基本原理是先将特异性的抗原或单克隆抗体固定于试纸条（硝酸纤维薄膜）的一端，检测时将试纸条的另一端浸入待测样品，由于毛细管作用，样品液向前移动，如待测样品中含有相应的抗体或抗原，则当样品液移至固定有抗原或抗体区时会发生特异性结合，在显色系统的作用下，该区域出现一定的颜色。此法具有操作简单，不需任何仪器，20 min即能报告结果，适合现场查病时使用。Dipstick试条上的固相用伤寒杆菌的IgM抗原包被，以胶体金作指示标记，检测血清中伤寒杆菌的IgM抗体。Tharwat［4］等用伤寒Dipstick纸片法、培养法和肥达反应同时对30例经实验室诊断为伤寒的患者进行检测，结果浸染试验在特异性、敏感性、简单、快速方面优于常规方法。
4 聚合酶链反应（PCR）
PCR是一种体外DNA扩增技术。其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增。由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。随着微生物基因组学的发展，对伤寒杆菌的基因结构已经清楚，1989年Frankel［5］等发现伤寒杆菌鞭毛蛋白存在着独立的超变基因区域，这个基因区域的核苷酸系列，能把伤寒杆菌与其他沙门氏菌区别开来。根据伤寒杆菌特异基因序列，设计引物，进行PCR检测，是现阶段检测伤寒杆菌的最快速准确的方法。
4.1 套式聚合酶链反应（Nested?PCR） Nested?PCR又称二次PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增。Kumar［6］等根据伤寒杆菌鞭毛基因多变区核苷酸系列设计一对外引物：5?ACTGCDAAAACCACTACT?3（位点：1072?1089）、5?TTAACGCAGTAAAGAGAG?3（位点：1513?1530）进行第一轮PCR，扩增出其中的的特异性片段为458bp。然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物：5?AGATGGTACTGGCGTTGCTC?3（位点：1092?1111）、5?TGGAGACTTCGGTCCCGTAG?3（位点：1416?1435）再次扩增，扩增出其中的的特异性片段为343bp。他们对40例临床上疑似伤寒的患者，采血进行Nested?PCR检测及血液培养，同时，在相同条件下对20例非伤寒杆菌的血标本进行PCR检测和培养。结果血培养阳性的20例中，PCR亦全部阳性；血培养阴性的20例中，PCR呈阳性12例；非伤寒杆菌对照组PCR及培养均呈阴性。其特异性（100%）和敏感性（100%）明显高于传统（血、骨髓）培养法，并且敏感性不受预先抗菌的影响，整个实验在10 h～12 h内完成 。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，因此试验的敏感性和特异性均增强。在一定情况下，这种方法对减少后扩增产物的污染问题极为有用，但也增加了每次试验的复杂性。
4.2 一次PCR 只设计一对引物用于PCR即完成检测。Massi［7］等根据伤寒杆菌鞭毛蛋白基因序列，设计一对引物（ 5?ACTGCDAAAACCACTACT?3、5?TGGAGACTTCGGTCGCGTCGT?3），扩增产物为367bp的碱基对。在这个实验中，他们对6株伤寒杆菌和8株非伤寒杆菌同时进行PCR扩增，结果只有6株伤寒杆菌出现367bp的特异性扩增区带，其他8株非伤寒杆菌均未出现367bp的扩增区带。他们对73例疑似伤寒的患者采用PCR、血培养和肥达试验同时检测，结果阳性率分别为63%、13.7%和35.6%。采用一次PCR比Nested?PCR省时省力又降低成本。但一次PCR检测临床血标本容易受到血中大量存在的外周单个核细胞DNA非特异性扩增的影响而使敏感性降低。
4.3 多重PCR 多重PCR是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增的PCR。由于伤寒杆菌有多种不同的抗原基因，只针对鞭毛抗原基因的单一PCR，有时会漏检。多重PCR能全方位高效率地检测伤寒杆菌。Kumar［8］等针对伤寒杆菌的侵袭基因（invA）、O抗原基因（prt）、H抗原基因（fliC?d）和表面抗原基因（ViaB）设计不同的引物，在同一PCR反应体系内同时扩增invA、viaB、fliC?d and prt基因，以培养法为金标准，对25份水样和伤寒杆菌阳性对照进行检测，结果显示，25份水样均未检出伤寒杆菌，阳性对照最低检测量牛奶和水标本分别为4.8 cfu/ml和2.0 cfu/ml，并且不出现假阳性和假阴性。与其他常规方法相比，多重PCR灵敏性更高，结果更准确、可靠。
4.4 免疫磁珠分离PCR（IMS?PCR） 免疫磁珠（immunomagnetic bead, IMB）就是将直径0.05 μl～4 μl具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。被检测样品在磁板背景下与IMB混合，若有相应的抗原存在，IMB就会将其捕获，利用磁性将IMB聚集，然后进行分离，用于PCR测定。Kumar［9］等用伤寒杆菌抗鞭毛多克隆抗体包被环氧超顺磁珠，人工配制含伤寒杆菌不同浓度的食物和水标本，然后再采用IMB对标本中的伤寒杆菌进行IMS，用于下一步的PCR检测。他们根据伤寒杆菌鞭毛蛋白基因序列，设计一对引物（5 TGGGCGACGATTTCTATGCC?3、5?TTTGCGGAACCTGGTTGGCC?3），预期的扩增产物为489bp。对5份肉类、5份牛奶、5份蔬菜、5份水样等标本进行IMS?PCR检测，同时用常规PCR平行检测。结果显示伤寒杆菌最低检出量分别为2×105 cfu/ml、15×105 cfu/ml、15×103 cfu/ml、2×103 cfu/ml，与常规PCR检测结果相符。这个试验中，检测伤寒杆菌的敏感性较差，特别是牛奶，可能与牛奶的脂质微粒和其他干扰因素多有关。IMS?PCR技术最突出的优点是特异性强，可以明显提高准确性，仅用6 h就能完成检测结果。
4.5 实时荧光定量PCR（Real?time PCR） 常规PCR检测需要从反应体系中吸取产物作模板DNA进行签定，转移过程中容易受外源DNA的污染，并随样品中待检DNA一起扩增，造成假阳性。最近起来的Real?time PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，借助荧光信号检测扩增产物，利用荧光信号的累积来实时监测整个PCR的进程。Massi［10］等针对从血标本分离出的伤寒杆菌鞭毛蛋白基因，设计引物和TaqMan探针系列，对55份疑似伤寒患者的血标本进行检测。结果显示，其中8例培养阳性的血标本，每毫升血中伤寒杆菌的浓度范围为1.01×103 cfu～4.35×104 cfu；在47例血培养阴性标本中，Real?time PCR检测出40例阳性，每毫升血中伤寒杆菌的浓度范围为3.9×102 cfu～9.9×102 cfu拷贝。由于Real?time PCR特异性高、敏感性好，克服了常规PCR难以定量和重复性差的缺点，自动化程度高，操作简便，具有广阔的应用前景。但需要昂贵的荧光检测仪和荧光分子探针，不利于基层实验室推广。检测伤寒杆菌的方法很多，各有其优缺点，随着分子生物学理论与技术的发展及新仪器研发，伤寒杆菌的检测方法将向早期、快速、准确、灵敏、特异等方向发展，特别是免疫、PCR等现代分子生物学技术的联用及Real?time PCR的进一步完善，伤寒杆菌的检测方法将日臻成熟，为临床诊断提供更加快速准确的依据。
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