两种产β-内酰胺酶细菌的检测方法和耐药性的研究
【摘要】 目的：了解产β?内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌的耐药性及比较两种ESBLs检测方法的临床应用。方法：使用双纸片协同试验、纸片表型确证试验检测2005年1月至2006年5月我院分离的302株克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌，比较两种方法的检出率及其差异；使用国际标准平皿二倍稀释法测定148株产ESBLs细菌抗生素的耐药率、中介率、敏感率。结果：两种检测产ESBLs细菌方法比较检出率无明显差异；148株产ESBLs大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌对亚胺培南、美罗培南均敏感，氨苄西林、哌拉西林、头孢唑林、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、复方新诺明、庆大霉素、头孢哌酮耐药率在60%以上。结论：纸片表型确证试验和双纸片协同试验是临床检出产ESBLs菌株最迅速、最简便、最的方法；产ESBLs大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌对大多数广谱β?内酰胺类抗生素高度耐药，亚胺培南、美罗培南是产ESBLs大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌的最佳药物。
【关键词】 β?内酰胺酶；大肠埃希菌；克雷伯菌属；耐药性
致病菌对抗生素的耐药是临床抗感染治疗过程中经常面临的棘手问题。抗生素耐药不仅仅是一个重要的医学问题，且已经逐渐成为一个严重的社会问题。近年来，随着广谱β?内酰胺抗生素，尤其是第三代头孢菌素的广泛使用，超广谱β?内酰胺酶(Extended?Spectrum β?Lactamases， ESBLs)所介导的β?内酰胺抗生素耐药问题成为人们关注的焦点。产ESBLs克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌引起的院内感染爆发流行在世界各地均有报道，大部分发生于重症监护病房(ICU)，但在肿瘤病房、血液科病房、儿科病房和老年慢性病病房也经常发生。近年来本院克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌院内感染率不断增高，因此有必要明确产ESBLs克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌感染发生率、耐药情况，以便采取有效措施加以控制。本文对2005年1月至2006年5月从门诊和住院患者的标本中分离的302株克雷伯菌属细菌和大肠埃希菌进行了ESBLs监测和研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 患者菌株：2005年1月至2006年5月本院各种临床标本中分离的223株大肠埃希菌和79株克雷伯菌属细菌。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922敏感质控株；大肠埃希菌ATCC 35218酶抑制剂的质控株；肺炎克雷伯菌ATCC 700603(产SHV?18)产ESBLs的质控株。
1.1.2 试剂
1.1.2.1 培养基 革兰阴性菌选择性培养基：蓝琼脂平板(英国Oxoid公司)；药敏培养基:Muller?Hinton琼脂平板(英国Oxoid公司)。
1.1.2.2 细菌鉴定试剂 肠杆菌科细菌生化鉴定编码管(杭州天和微生物试剂有限公司)；VITEK2革兰阴性菌鉴定卡ID?GNB(法国生物梅里埃公司)。
1.1.2.3 抗生素纸片 CTX(30 μg/片)、CAZ(30 μg/片)、CRO(30 μg/片)、ATM(30 μg/片)、AMC(20/10 μg片)、TCC(75/10 μg/片)、CTX/CLA(30/10 μg片)、CAZ/CLA(30/10 μg片)(上述纸片均为Oxoid产品)。
1.2 方法 ESBLs检测及产ESBLs细菌耐药性检测
1.2.1 菌种鉴定方法 鉴定方法均经常规鉴定技术鉴定，疑难菌使用VITEK2微生物自动分析仪(法国生物梅里埃公司)进一步鉴定。
1.2.2 ESBLs检测方法 对所有临床分离大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌分别用以下方法检测产ESBLs菌株。方法：双纸片协同试验筛选ESBLs菌株。
1.2.2.1 阿莫西林双纸片协同试验筛选ESBLs菌株 双纸片协同试验按标准纸片琼脂扩散法操作，制备菌悬液,涂布Mueller?Hinton琼脂平板。将含克拉维酸的阿莫西林/克拉维酸药敏纸片贴于Mueller?Hinton琼脂平板中心，头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、氨曲南4种纸片均匀贴于AMC的周围，与AMC纸片相距均为 25 mm(以纸片中心间距为准)，35 ℃孵育20 h～22 h。如任一纸片与AMC纸片间出现协同抑菌区(“坑”或“匙扣”现象)为协同试验阳性,否则为阴性。
1.2.2.2 替卡西林双纸片协同试验筛选ESBLs菌株 替卡西林双纸片协同试验操作、孵育、判定同1.2.2.1，将替卡西林/克拉维酸药敏纸片替代阿莫西林/克拉维酸药敏纸片贴于Mueller?Hinton琼脂平板中心。NCCLS纸片表型确证试验检测ESBLs菌株:参照NCCLS 2004的M2?A8文件表2A，确证标准参照NCCLS 2004推荐的标准。
1.2.3 药物敏感试验方法 琼脂稀释法：操作及药敏试验结果解释参照NCCLS M7?A6及NCCLS M100?S14 2004年版本进行。对通过NCCLS纸片表型确证试验和琼脂稀释法表型确证试验检测出的ESBLs产生株(112株大肠埃希菌、36 株克雷伯菌属细菌)用琼脂稀释法做抗生素的 MIC。数据分析及处理：全部药敏结果输入世界卫生组织(WHO)耐药监测组提供的WHONET?5软件，分析耐药模式。
2 结果
2.1 产ESBLs菌株的检出以及各检出方法的比较 双纸片协同试验筛选ESBLs菌株及两种方法检出率的比较,见表1、表2。
表1 阿莫西林双纸片协同试验、替卡西林双纸片协同试验检测ESBLs菌株结果（略）
注：*以NCCLS纸片表型确证实验为标准。
表2 两种检出产ESBLs大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌方法的比较（略）
2.2 148株产ESBLs细菌的耐药率测定结果 见表3。
表3 148株产ESBLs细菌的耐药率测定结果（略）
3 讨论
3.1 ESBLs的检测方法 虽然大多数ESBLs对一种或多种三代头孢、单环类β?内酰胺类抗生素耐药，但是按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的解释指南，β?内酰胺酶并不总是使MIC值升高至足以判为耐药的水平。检测ESBLs的药敏试验的灵敏度和特异性随检测的头孢菌素而变。因此目前需要一种实验室检测方法准确的鉴别出临床分离菌株中ESBLs的存在。目前检测ESBLs的常用方法有双纸片协同试验、纸片表型确证试验、琼脂稀释法确证实验、三维试验等。本研究使用两种双纸片协同试验，即阿莫西林双纸片协同试验与替卡西林双纸片协同试验，以NCCLS纸片表型确证试验测定结果为标准，筛选出产ESBLs大肠埃希菌112株，克雷伯菌属细菌36株，两种试验相比，经χ2检验，两种方法检出率无明显差异(P>0.05)，并有较好的一致性。纸片表型确证试验和双纸片协同试验是临床检出产ESBLs菌株最迅速、最简便、最的方法。然而，还没有一种检测方法是以β?内酰胺酶产生的基因型为基础，因此就不可能在准确的检测革兰阴性菌中的产ESBLs菌株实验中表现为100%的灵敏度和100%的特异性，我们应进一步改变ESBLs的检测方法。
3.2 ESBLs检出率 产ESBLs细菌的检出率在不同的国家和不同的报道不尽相同。在美国不同医院中肠杆菌科细菌ESBLs的检出率为0%～25%，平均在3%左右。在ICU和非ICU病室中的耐头孢他啶的肺炎克雷伯菌的检出率：美国分别为10%和5%，欧洲分别为42%和20%。2002年国家细菌耐药性监测网报道产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌株的检出率分别为18.2%和22.6%［1］；北京医院报道大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs合计的阳性率为22.9%［2］；本研究发现，以纸片表型确证试验为准，ESBLs检出率在大肠埃希菌中为50.22%(112/223)，在克雷伯菌属细菌中为45.57%(36/79)。与其他地区相比，本地区产ESBLs大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌的检出率较高，因此我们建议本地区有必要建立ESBLs的检测方法，重视ESBLs的检测，准确及时的检测出ESBLs阳性菌株，指导临床用药。
3.3 产ESBLs细菌的耐药模式分析 典型产ESBLs菌株对头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南中的一种或多种耐药。产ESBLs细菌的质粒上还往往连锁携带耐氯霉素、磺胺类、四环素等的耐药基因，造成对氯霉素、磺胺类、四环素耐药。此类菌株往往对氨基糖苷类和喹诺酮类也耐药［3］。各地区抗生素使用不同及存在医院内携带不同ESBLs耐药质粒的流行导致各地区耐药表型不同。目前，ESBLs疗效最好的是碳青霉烯类，如亚胺培南、美罗培南等。然而，令人担忧的是：随着碳青霉烯酶、质粒介导的AmpC酶和ESBLs不断的出现，我们将很难找到有效的β?内酰胺类抗生素来治疗这些耐药株； 总之，合理地使用第三代头孢菌素，已成为减少ESBLs引发耐药的关键。可以预见，碳青霉烯类在将来治疗革兰阴性杆菌引起的感染中将逐渐扮演重要的角色。我们也期待着更多的对AmpC酶和ESBLs稳定的新药的出现。
【】
［1］ 马越,李景云,张新妹,等.2002年临床常见细菌耐药性监测［J］.中华检验医学杂志,2004,27:38?45.
［2］ 胡云建,俞云松,张秀珍,等.产超广谱β?内酰胺酶细菌的分子流行病学研究［J］.中华医院感染学杂志，2004,14:241?244.
［3］ Paterson DL，Mulazimoglu L, Casellas JM, et al. Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to extended?spectrum β?lactamases production in Klebsiella pneumoniae isolates causing bacteremia［J］. Clin Infect Dis, 2000，30:473?478.
