肺癌患者Th1/Th2细胞因子的免疫反应状态变化及临床意义
作者：黄萍萍，唐德燊，吴平，陈捷，何惠娟，杨展
【摘要】 目的：分析肺癌患者外周血分泌不同细胞因子的T细胞数以及血清中6种细胞因子的水平，为肿瘤的免疫提供实验依据。方法：先用刺激物刺激外周血T细胞，以增加细胞内细胞因子的表达，继用流式细胞仪分析特异性细胞因子表达水平。同时用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中相应的细胞因子量。结果：肺癌患者Th1型细胞因子干扰素?γ(IFN?γ)、白细胞介素?2(IL?2)、白细胞介素?12(IL?12)表达水平较正常对照组显著降低，Th2型细胞因子白细胞介素?4(IL?4)和白细胞介素?10(IL?10)表达水平较正常对照组升高，差异有显著性。肿瘤坏死因子?a(TNF?a)表达水平较正常对照组升高，差异有显著性意义。结论：肺癌患者体内Th2型细胞因子模式占优势状态，这可能是肿瘤细胞发生免疫逃逸的原因之一。
【关键词】 肺癌；细胞因子；辅助性T淋巴细胞亚群；流式细胞术
The Reaction State and Clinical Signficance of TH1/TH2 Cytokines in Lung Cancer
Abstract： Objective To analysed the amount of Tlymphocytessecreting different cytokines by peripheral blood and the serum level of those cytokines in the patients with lung cancer． In order to find out the laboratory evidence of tumor immunotherapy．Methods The peripheral blood lymphocytes were stimulated by Stimulator in order to enhance expression of cytokines . Those cytokines were detected by flow cytometry and enzyme linbed immunosorbent assay(ELISA)． Results The level of Th1 type cytokines such as interferon?γ(IFN?γ),intreleukin?2(IL?2)，interleukin?12(IL?12) were significantly lower in patients with lung cancer than those normal controls． The levels of Th2 type cytokines such as interleukiin?4(IL?4)，interleukin?10(IL?10)were higher in pstients with lung cancer than those in normal controls,but there were not significant difference between them.The level of tumor necrosis factor a(TNF?a)in patients were significant higher than that in normal control. Conclusion Th2 type cytokines are dominant in lung cancer.It maybe one of the causes of immune escape.
Key words: Lung cancer;Cytokines;Th1/Th2 subsets;Flow cytometry
辅助性T细胞(Th)对机体免疫系统有重要的调节作用。人在正常的生理情况下，Th1、Th2两类细胞处于相互抑制、相互转化的平衡状态，一旦平衡被打破，机体就会处于Th1优势或Th2优势的漂移状态，从而出现各种病理反应，甚至发生肿瘤［1，2］。近年来的研究发现，多数肿瘤患者体内呈现Th2优势的漂移状态［3～5］，并且肿瘤本身也可分泌多种细胞因子，影响肿瘤的微环境，因此肿瘤患者体内Th1/Th2状态与肿瘤发生、及预后密切相关。我们应用流式细胞仪通过CytodetectTM试剂盒检测肺癌患者CD3+T细胞分泌细胞因子的表达，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中相应的细胞因子水平，分析患者的Th1/Th2免疫反应状态的变化，现结果报道如下。
1 对象和方法
1.1 对象与试剂
1.1.1 对象 病理确诊的肺癌48例，年龄36岁～70岁，平均年龄54.5岁；男37例，女11例；其中磷癌23例，腺癌16例，小细胞未分化癌9例。所选病例均经临床和病理诊断证实。正常对照30例，年龄42岁～75岁，平均58.5岁，均为健康体检者。
1.1.2 仪器 美国Coulter EPICSXL型流式细胞仪，美国Bio?Rad 550型酶标仪，美国NAPCO 5410型二氧化碳培养箱，日本三洋MDF?3820型-70℃超低温冰箱，上海安亭仪器厂TDL?5A型离心机。
1.1.3 试剂 全套人CytodetectTM试剂盒(荷兰IMMUNO QUALITY公司产品)；RPM1 1640培养液系美国GIBCO公司产品；淋巴细胞分离液系上海华精生物高科技有限公司产品；白细胞介素?2(IL?2)、白细胞介素?4(IL?4)和肿瘤坏死因子?2(TNF?a)ELISA检测试剂盒系美国GeneMay公司产品；白细胞介素?10(IL?10)、白细胞介素?12(IL?12)和IFN?γ ELISA检测试剂盒系美国Genzyme公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 采集标本 所有患者均在手术前或化疗前分别抽取静脉血7 ml，其中2 ml分离血清，-70 ℃冻存，用于细胞因子的ELISA测定；5 ml血肝素抗凝，用于Gytodetect测定。
1.2.2 Cytodetect测定 采用CytodetectTM试剂盒提供的方法及［6］方法进行检测。
1.2.3 相应的细胞因子检测 采用ELISA法，严格按说明书进行操作。
1.2.4 统计学处理 用SPSS 10．0统计软件对实验数据进行统计学分析，所有数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较用t或t’检验，资料不符合正态分布的，进行资料转换后再进行统计，以α＝0．05为检验水准，P＜0．05为有统计学意义。
2 结果
2.1 肺癌患者外周血CD3+T细胞表达IL?2、IL?4、 IL?10、IL?12、 IFN?γ TNF?a细胞的百分比 表1提示肺癌患者Thl型细胞因子IL?2、 IL?12和IFN?γ表达水平较正常对照组显著降低(P＜0．01)，而TNF?a表达水平较正常对照组显著升高(P＜0.05）；Th2型细胞因子IL?4、IL?10表达水平较正常对照组升高(P＜0．05)，差异有统计学意义。
表1 不同病理组癌患者与正常人外周血中6种细胞因子表达的比较（略）
注：正常对照组比较，*P＜0.05、**P<0.01。
2.2 肺癌患者血清细胞因子水平及其与肿瘤病理之间的关系 表2结果显示，不同病理组的肺癌患者血清IL?2和IFN?γ与正常对照组相比均显著降低（P＜0.01），但各病理组之间差异无显著性。不同病理组的肺癌患者血清IL?4和IL?10水平均显著高于正常对照组（P＜0.05）；不同病理组的肿瘤患者的血清INF?a显著高于正常对照组（P＜0.01），各病理组间差异无显著性（P＞0.05）；肺癌组IL?12水平低于正常对照组，尤以小细胞未分化癌组降低显著（P＜0.01）。
表2 肺癌患者血清细胞因子水平（pg/ml)的变化（略）
注：与正常对照组比较，*P＜0.05、**P＜0.01。
3 讨论
传统检测Th1/Th2细胞的方法，多采用对标本中T淋巴细胞进行培养后测定培养上清液中的细胞因子成分，通过上述细胞因子的比率而推算Th1/Th2细胞频率，不够精确而且费时。本研究采用荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体结合细胞固定、破膜打孔技术，用流式细胞仪来检测单个细胞水平内细胞因子的方法，能够大大地增加对Th1/Th2亚群检测的敏感性和特异性［7］。我们利用流式细胞术测定肺癌患者T细胞Th1型细胞因子IL?2、IL?12、IFN?r、TNF?α，Th2型细胞因子IL?4和IL?10的表达，发现肺癌患者表达Th1型细胞因子的CD3+T细胞比例较正常人对照组明显降低；表达Th2型细胞因子的CD3+T细胞比例与正常人对照组升高，差异有显著性；提示肺癌患者Th1型反应模式占弱式状态，相对地Th2型反应模式处于优势状态，Th1/Th2平衡失调，Th1/Th2平衡向Th2方向漂移。与此同时，患者血清的细胞因子水平亦表现为Th2优势状态，并且随着肿瘤分化程度的降低，这种趋势更为明显，提示肺癌患者由于Th1细胞的抑制，细胞免疫功能不能有效地激活，从而不利于机体组织以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞得以生存。TNP?α同样是由Th1细胞分泌，其生物活性是将导致肿瘤细胞出血坏死。我们研究的结果显示，肺癌患者血清INF?α水平较正常对照组显著升高，但实际升高值并未显示理论上应有的抗肿瘤效应。我们推测这可能是 TNF?α，只是机体免疫反应的某个环节，在机体其他免疫功能受损较重的情况下，TNF?α行使其抗肿瘤效应的优势未能显示出来。本研究证实肺癌患者呈现Th2类细胞因子表达优势漂移，可能正是其发生免疫逃逸的一种机制之一，不利于机体组织的抗肿瘤反应，所以了解肺癌患者Th2类细胞因子的优势漂移，对指导临床具有重要的意义。
【】
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