正交试验法优选盐酸小檗碱脂质体制备工艺
作者：陈俊威，谭丽蓉，李伟恩，李国强
【摘要】 目的：优选盐酸小檗碱脂质体的制备工艺。方法：采用主动加药法制备盐酸小檗碱脂质体，在单因素考察基础上采用正交试验设计，以包封率为评价指标，筛选脂质体制备的最佳工艺条件。结果：最佳制备工艺为A2B1C1D1，即卵磷脂与胆固醇之质量比为3∶1，药脂质量比1∶30，孵化时间为20 min，孵化温度60 ℃。制备3批脂质体，平均包封率为（78.51±2.45）％，粒径范围为2.2 μm~3.5 μm。结论：所选工艺制备的脂质体包封率较高，粒径分布较均匀。
【关键词】 盐酸小檗碱；脂质体；正交试验法；包封率;制备工艺
Study on the Preparation Process of Berberine Hydrochloride Liposomes by Orthogonal Design
Abstract: Objective To optimize the preparation process of berberine hydrochloride liposomes. Methods Liposomes were prepared by active loading method,. Orthogonal design was adopted to screen the preparation of berberine hydrochloride liposomes after the study of different single variables. The optimal technological conditions were acquired by the evaluation of the encapsulation efficiencies. Results The optimal preparation conditions of berberine hydrochloride liposome were as follows: the proportion of berberine hydrochloride and lipids in weight was 1:30, soybean phosphatidylcholine: cholesterol = 3:1, incubation time was 20 minutes and incubation temperature was 60 ℃.The average encapsulation efficiency of the optimized liposomes was （78.51±2.45）% and their size range was 2.2 μm~3.5 μm. Conclusion The entrapment efficiency and particle size of the optimized berberine hydrochloride liposomes are satisfactory.
Key words: Berberine hydrochloride; Liposomes; Orthogonal design; Encapsulation efficiency; Preparative process
盐酸小檗碱（黄连素）是从毛茛科植物根茎中提取的一种异喹啉生物碱，临床主要用于清热解毒、肠道感染，近年发现还有治疗心律失常、高血压、高脂血症、糖尿病和抗肿瘤等作用。研究发现，盐酸小檗碱对人类肝癌细胞、艾氏腹水瘤、结肠癌细胞、食道癌细胞系、鼻咽癌细胞、膀胱癌细胞、恶性畸胎瘤细胞、大鼠9 L脑肿瘤细胞等都具有一定的抑制和杀灭作用［1］。黄林清［2］等在进行抗肿瘤的实验中发现，盐酸小檗碱体内抑瘤作用没有体外作用明显，可能与其肠道吸收差，在体内很难达到对肿瘤细胞有效的血药浓度有关。脂质体是一种新的给药系统，能增加药物局部浓度，提高药物疗效，减少药物的不良反应。笔者等拟采用正交试验法考察盐酸小檗碱脂质体的制备工艺，现报告如下。
1 仪器和试药
1.1 仪器 RE?52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； UV?2401型紫外分光光度计（日本岛津）； JEM?2000Ex型透射显微镜（日本）。
1.2 试药 盐酸小檗碱（四川什邡华安药物原料有限公司）；卵磷脂（SPC，华东师范大学化工厂）；胆固醇（CH，医药上海化学试剂公司，分析纯）；维生素E（VE，浙江医药股份有限公司新昌制药厂）；阳离子交换树脂（上海树脂厂）；其他试剂为分析纯。
2 方法
2.1 正交试验设计 脂质体的评价指标有很多，如包封率、载药量、粒径分布、稳定性等，其中包封率是衡量脂质体品质优略的重要指标，药典有明确规定，临床用药脂质体的包封率不得少于80％［3］，为此以包封率为评价指标进行处方筛选。在预试验的基础上，着重考察了SPC：CH、药脂比、孵化时间、孵化温度4个因素，每个因素取3个水平，按L9(34)安排正交试验，因素水平表见表1。
表1 因素水平表（略）
2.2 主动载药法制备脂质体
2.2.1 枸橼酸缓冲液的配制 称取枸橼酸10.5 g，枸橼酸钠7 g，加水溶解，并配成1 000 ml，混匀，即得（pH 3.64）。
2.2.2 碳酸氢钠溶液的配制 称取NaHCO3 50 g，加水溶解并配成1 000 ml，混匀，即得（pH 8.32）。
2.2.3 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 取磷酸二氢钾6.8 g，加0.1 mol/L?1NaOH液291 ml，用蒸馏水稀释至1 000 ml，用磷酸调pH值至7.0。
2.2.4 盐酸小檗碱脂质体的制备 按上述处方安排，将SPC—CH—VE按一定比例溶于适量无水乙醇，于60 ℃水浴中加热溶解，减压蒸发，制备卵磷脂膜后，加入枸橼酸缓冲液，水化，得空白脂质体，将所得空白脂质体用0.8 μm的微孔滤膜过滤后，加入Bb溶液，并加入NaHCO3溶液调外水相pH值，水浴孵化，得到Bb脂质体混悬液（1 mg/ml?1）。
2.3 包封率的测定
2.3.1 测定波长的选择 紫外分光光度计全波长扫描盐酸小檗碱水溶液，发现盐酸小檗碱在190 nm～500 nm间有4个吸收峰，分别是242 nm、268 nm、344 nm、422 nm，其中242 nm和344 nm处的吸收峰较大，为了避免卵磷脂吸收峰（最大吸收波长为210 nm）的干扰，选择344 nm为测定波长。
2.3.2 样品吸收光度值A的测定 取盐酸小檗碱脂质体混悬液0.1 ml两份，一份直接加入10 ml的量瓶中，加入95％乙醇6 ml溶解，用PBS稀释至刻度，摇匀；另一份加于阳离子交换树脂顶端吸附，然后用PBS洗脱，收集滴出液于10 ml的量瓶中，加入95％乙醇6 ml溶解脂质体，用PBS稀释至刻度，摇匀，分别于344 nm处测定吸收光度值A。包封率E%=(A1/A2)×100％(其中A1、A2分别为过阳离子柱和未过阳离子柱样品的A值)
2.4 脂质体的形态和粒径分布 将样品涂在有支持膜的铜网上，用磷钨酸进行负染，凉干，用透射电镜观察脂质体的形态和粒径分布。
3 结果
3.1 正交试验结果 以盐酸小檗碱脂质体的包封率为评价指标，对正交试验数据（表2）进行分析处理。
表2 正交试验结果（略）
结果显示最佳制备条件为A2B1C1D1，即卵磷脂与胆固醇之质量比为3∶1，药脂质量比1∶30，孵化时间为20 min，孵化温度60 ℃。影响因素的先后顺序如下：药脂质量比＞卵磷脂与胆固醇质量比＞孵化时间＞孵化温度。
3.2 脂质体的形态和粒径分布 在透射电镜下，可看到脂质体颗粒多呈球形或者类球形，粒径大小分布大约在2.2 μm～3.5 μm范围内。
3.3 盐酸小檗碱脂质体的包封率 对按最佳制备工艺制得的3批脂质体（批号20060908、20060912、20060915）进行包封率测定，包封率分别为80.23％、75.71％和79.60％，平均包封率（78.51±2.45）％。
4 讨论
综上所述，盐酸小檗碱脂质体的最佳制备工艺为卵磷脂与胆固醇之质量比为3∶1，药脂质量比1∶30，孵化时间为20 min，孵化温度60 ℃。制备3批脂质体，平均包封率为（78.51±2.45）％，较邓意辉等［4］报道的84.6％略低，但较被动载药法35％～60％的包封率［5，6］又明显高许多。脂质体微粒的大小对其体内分布有直接的影响。一般认为：粒径＜50 nm，可透过肝内皮，通过淋巴转入脾、骨髓和肿瘤组织；粒径为100 nm～200 nm，被巨噬细胞内吞，集中肝细胞；粒径为1 μm～12 μm多被肺摄取。本方法制备的脂质体粒径多在2.2 μm～3.5 μm之间，其体内分布如何、能否进入各肿瘤组织？有待进一步研究。盐酸小檗碱极性较大，在胃肠道吸收极少，制成脂质体后，可增加其脂溶性，增加吸收。有关该脂质体的稳定性、体内血药浓度、肿瘤组织的药物浓度和临床疗效等，将作进一步研究。
【】
［1］ 罗彪.黄连素抗肿瘤及放疗增敏作用的研究进展［J］.右江民族医学院学报，2004，26（2）：278.
［2］ 黄林清，徐传福.小檗碱抗肿瘤作用实验研究［J］.药报，1997，13（2）：189.
［3］ 中国药典.2000年版［S］.二部，附录203.
［4］ 邓意辉，王绍宁，吴琼，等.主动载药法制备盐酸小檗碱脂质体［J］.中国药学杂志，2004，39（1）：40?42.
［5］ 徐丽君，陆付耳，魏世超，等.盐酸小檗碱脂质体的制备方法及质量研究［J］.中国药学杂志，2004，24（6）：325?326.
［6］ 万东华，高瑜，周训胜，等.硫酸氢黄连素脂质体的制备工艺研究［J］.福州大学学报（自然版），2004，32（1）：98?100.
