两种洗板方法在ELISA中的应用分析

【摘要】  目的：探讨酶联免疫试验(ELISA)中的洗板技术，试图找到一种简单、高效、、实用、可靠的ELISA洗板方法。方法：对753例临床体检乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的标本，分别用手工法和全自动洗板机法两种方法进行洗板，进行组间对比分析；将弱阳性标本选出，重新检测2次，分别用两种方法洗板，看看弱阳性是否因洗板方法不同引起。结果：753例用ELISA方法检测HBsAg试验中，用手工法洗板和用洗板机洗板，经χ2检验，P>0.05，两种洗板方法差异无显著性；18例弱阳性标本检测中，洗板方法的不同，不是造成假阳性的根本原因。结论：两种洗板方法无差别，在ELISA实验中，手工法可以代替洗板机法洗板。手工法简单、高效、实用，应可规范推广。

【关键词】  ELISA洗板；洗板方法；弱阳性

　　Comparison between Two Cleaning?methods on ELISA

　　Abstract: Objective To investigate the cleaning?technology of the ELISA. Try to find a simple high?effective and utility cleaning?troughs method. Methods To use handle method and auto?washing?machine method to clean the troughs of HBsAg with ELISA in 753 health?checking peoples, Compared between the two cleaning?methods; Meanwhile, to select weak positive samples out and test repeatedly two times, to clean the troughs with the two methods, whether does it exist difference between the two methods.whether does it cause the fake positive by the cleaning methods. Results There is not significant difference(P>0.05)to clean troughs with the two cleaning?methods in testing HBsAg with ELISA in 753 cases,The cleaning?method isn't the real cause of the fake positive in testing 18 serum samples of weak?positive. Conclusion Washing with the two cleaning?methods, the result has not difference.the wash?machine method can be substituted by the handle method. the handle method is simple, high?effective and practice.

　　Key words: ELISA Cleaning?troughs; Cleaning?methods;Weak?positive

　　在酶联免疫试验中，洗板是非常重要的过程。酶联免疫试验(ELISA)洗涤过程虽不是一个反应过程，但却也决定着实验的成败［1］。ELISA就是通过洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的，通过洗涤以清除残留在微孔板中未能与固相抗原或抗体相结合的物质，以及在反应过程中的非特异性吸附于固相载体上的干扰物质。聚苯乙烯对蛋白质的吸附是普遍的，在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，洗涤时又应将这些非特异性吸附的干扰物质洗涤掉。在ELISA操作中，洗涤是非常关键的，应引起操作者的高度重视。我们对753例用ELISA方法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的洗板过程进行了检测，采用我们自创的人工洗板法和全自动洗板机洗板对比试验，现将结果报告如下。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  标本来源及类型  753例标本来源于广东省深圳市龙岗区南岭人民2005年12月8日至2006年1月4日的工厂体检血清标本，其中男性121例，女性653例，年龄17岁～43岁,平均年龄为30岁。

　　1.1.2  乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)由上海荣盛生物技术有限公司生产。

　　1.1.3  一个大的脸盆和一些棉质毛巾。

　　1.1.4  消毒剂  健之素(含有效氯500 mg/片)。

　　1.1.5  特建一个有开关口的洗涤池。

　　1.1.6  全自动洗板机  美国MultiwashⅡ。

　　1.2  方法

　　1.2.1  手工法  按试剂说明书严格操作，稀释液用蒸馏水按1∶20稀释浓缩洗液，适量置于脸盆之中。从37 ℃水浴温箱中拿出温浴到时的反应板，到洗涤池处，放开自来水约1 min，然后快速甩掉反应液，即用自来水冲洗数次，甩掉水并用干净的毛巾吸干，放入配好洗涤液的脸盆之中，浸泡5 min～10 min，然后将反应板取出，甩掉洗涤液，再用自来水冲洗数次，用干净吸水的毛巾拍干(多次)反应板。加显色剂A、B后，振荡封板，放入37 ℃水浴温箱10 min，取出，加终止液，振荡，上酶标仪读板，观察结果。按感染性医疗废物处理洗涤池的液体及用过的洗涤液：加入健之素(500 mg/片)，使其浓度达到2 500 mg/L，浸泡24 h，收集起来，交医疗废物处理公司处理。

　　1.2.2  洗板机法  按试剂说明书严格操作，稀释液用蒸馏水按1∶20稀释浓缩洗液，适量置于洗板机洗液瓶里。将反应到时的反应板取出，用洗板机洗板5次，每次浸泡1 min，取出，用干净的毛巾拍干(多次)反应板。加显色剂A、B后，振荡封板，放入37 ℃水浴温箱10 min，取出，加终止液，振荡，上酶标仪读板，观察结果。

　　1.2.3  假阳性排除  实际工作中，我们发现假阳性一般显色都较淡，即弱阳性；为了排除假阳性，将753例中18例弱阳性(酶标仪读数0.105

　　1.2.4  假阴性的排除  753例标本检测中，每板都做双孔阴性对照和阳性对照，然后用两种方法洗板，结果两种洗板方法都未出现阳性对照阴性结果的现象，而阴性对照全部阴性。

　　1.3  统计方法  数据分析使用SPSS 11.5统计软件统计处理。

　　2  结果

　　2.1  两种洗板方法HBsAg检测结果比较  753例检测标本中，两种方法洗板以后，手工法阳性52例，洗板机法阳性53例，经χ2检验，χ2=0.01，P>0.05，两种洗板方法差异无显著性，结果见表1。

　　表1  753例HBsAg(手工法和洗板机法洗板)检测结果（略）

　　注：组间比较，χ2=0.01，P>0.05。

　　2.2  18例弱阳性标本的检测  用两种方法洗板，结果阳性15例，阴性3例为假阳性；弱阳性率占753例样本的2.39%(18/753)，假阳性占0.39%(3/753)。

　　2.3  3例弱阳性标本  经重新处理标本，重新检验，用两种方法进行洗板检测，结果3例都为阴性，而未出现1例阳性，确定3例为假阳性，应排除。

　　3  讨论

　　根据ELISA方法检测原理可知洗涤是为了去除未结合的多余的酶标物质，但又不能把结合的酶标物质洗脱，它即简单又重要，即可用手工法也可用机械法。笔者用ELISA法检测了753例体检血清标本的HBsAg，分别用我们自创的手工法洗板和全自动洗板机法洗板，进行组间比较，P>0.05，结果差异无显著性。也就是说可用手工法代替洗板机法洗板，两种洗板法得出的结果都可靠，我们认为用手工法洗板更加简单、高效，可提高工作效率。笔者对18例弱阳性标本进行了重复检测，并用手工法和洗板机法两种方法洗板测定，其中有3例弱阳性标本经重复检测后为阴性，确定为假阳性，假阳性占753例样本中的0.39%，假阳性往往显色都较弱，表现为弱阳性。弱阳性的出现，主要是由于标本没有处理好造成，伴有溶血或其他因素引起血清浑浊较为常见，而这些样品在HBsAg的ELISA检测中常出现假阳性［2］，纤维蛋白、红细胞、标本溶血是弱阳性发生的主要原因。尤其是纤维蛋白可非特异性地吸附在载体上，并吸附酶标抗体，难于彻底洗脱，因此，标本要充分凝固，离心要充分，使血清分离良好，吸样时不要吸到红细胞。如标本溶血较严重，建议重新取样，因为血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物酶的活性，在以辣根过氧化物酶(HRP)为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度过高，则其很容易在温育过程中吸附于固相上，从而与随后加入的HRP底物反应显色［3］。在假阴性方面，753例检测中，都做双孔阳性对照，结果两种洗板方法都未出现阳性对照阴性结果的现象，可见手工洗板法不会出现假阴性的现象。用手工法洗板、实用，只需一个脸盆，一个特建的洗涤池，成本非常低，并可长期使用，其经济实用不言而喻；而全自动洗板机，价格昂贵，对于基层是个不小的负担；对于大医院或繁忙的医院，则要多台同时使用，且容易堵塞、出故障，给工作带来不便，其维护、保养、维修也是一个不小的负担。在控制感染性医疗废物方面，只要严格要求，将使用后的洗涤液也倒入洗涤池之中，按2 500 mg/L的浓度，加入健之素，浸泡24 h，然后收集，交医疗废物处理公司处理，则完全可以控制感染。冲板用的自来水，只要符合国家自来水供水标准，便可使用，但洗板开始前，应打开自来水开关，让自来水空流1 min～2 min，以使沉积的脏水流去。遇自来水混浊时，不可使用。综上所述，在ELISA方法检验当中，手工法洗板和洗板机洗板，没有本质上的差别，两种方法结果都可靠。但手工法简单、经济、高效、实用，值得规范、推广。

【】
  　　［1］ 郑怀竞，韩松.临床检验ELISA指南［M］.北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1994：89.

　　［2］ 莫浩联.不同洗板方式的酶联免疫法对HBsAg结果的影响［J］.中华医学研究杂志，2004，4（10）：16.

　　［3］ 王兰兰，柳永和，李双庆，等.临床免疫学和免疫检验［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2005：256.