丙泊酚对大鼠急性肾缺血再灌注损伤的抗氧化机制研究

【摘要】  目的：探讨丙泊酚预处理对急性肾缺血再灌注损伤（acute renal ischemia reperfusion injury, ARIRI）的抗氧化保护作用及其机制。方法：建立大鼠急性肾缺血再灌注损伤模型，健康雄性SD大鼠54只，随机分为3组：假手术组、缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)组、丙泊酚预处理组。缺血再灌注前15 min、缺血再灌注后2 h、24 h分别检测血清尿素氮（BUN）、肌酐(Cr)、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及观察肾组织的病变化。结果：丙泊酚预处理组肾组织病理学变化明显轻于缺血再灌注组。与假手术组比较，缺血再灌注组中血清尿素氮、肌酐水平显著增加(P<0.05)，而丙泊酚预处理组尿素氮、肌酐水平则低于缺血再灌注组(P<0.05)。丙泊酚预处理组血清超氧化物歧化酶和丙二醛水平与缺血再灌注组均有统计学差异(P<0.05)。结论：在急性肾缺血再灌注损伤中，丙泊酚能起到对肾脏的保护作用。

【关键词】  丙泊酚；肾脏；缺血再灌注损伤；超氧化物歧化酶；丙二醛

　　Experimental Study about the Protective Effect of Propofol on Acute Renal Ischemia Reperfusion Injury in Rats

　　SONG Yan?fang, LIU Jian

　　(The First Affiliated Hospital of XinJiang Medical University, Urumqi， Xinjiang 830054,China)

　　Abstract：Objective To investigate the renal protection and mechanism of propofol in ARIRI rat models. Methods The model of rat's ARIRI was established. 54 SD rats were randomly divided into 3 groups: false operating group, ischemia reperfusion group and propofol group. BUN, Cr, SOD, and MDA were detected before I/R for 15 minutes and after I/R for 2 hours and 24 hours, and renal histopathology lesions were examined.Results Renal histopathology lesions of propofol preconditioning group decreased significantly after I/R. In I/R group, BUN and Cr serum levels increased significantly after I/R, compared with false operating group(P<0.05), while propofol decreased the serum levels of BUN and Cr significantly(P<0.05).There was statistic significance of the serum levels of SOD and MDA in Propofol preconditioning group and I/R group(P<0.05).Conclusion Propofol preconditioning to kidney could protect the kidney from ARIRI.

　　Key words：Propofol；Kidney；Ischemia reperfusion injury;SOD;MDA

　　缺血再灌注损伤(Ischemic reperfusion injury, IRI)是临床上导致缺血性急性肾功能衰竭的主要原因之一，病死率很高，且存活的患者亦多有不同程度的慢性肾功能损害，因此，如何减轻或避免肾IRI已成为多年来一直倍受关注的问题。丙泊酚作为静脉麻醉药，已证实有良好的抗氧化和抑制细胞因子释放，本研究从肾组织病理学变化、肾功能尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等三个方面探讨丙泊酚预处理对IRI的抗氧化保护作用及其机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料来源  取54只12周～14周的雄性SD大鼠为实验动物(由新疆医科大学实验动物中心提供),体重(250±10)g。丙泊酚注射液由西安力邦制药有限公司提供。

　　1.2  动物分组及实验方法  大鼠术前自由饮食,10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射麻醉后，用24号套管针股静脉穿刺置管,股静脉接微量注射泵,稳定10 min后开始实验。腹部正中切口进入腹腔,小心分离出双侧肾蒂，切除右侧肾，用无损伤微动脉夹夹闭左侧肾蒂60 min后解除阻断，观察肾脏颜色变化，确定血流5 min之内恢复，再灌注期关闭腹腔。54只雄性SD大鼠随机分为三组，每组18只。缺血再灌注组(I/R)组:肾脏缺血60 min，缺血前5 min从股静脉注射0.9%生理盐水0.3 ml/h，继之经微量泵持续输入0.9%生理盐水0.3 ml/h持续60 min；丙泊酚预处理组:肾脏缺血60 min，缺血前5 min从股静脉注射丙泊酚15 mg/kg，继之经微量泵持续输入丙泊酚(15 mg/kg)0.3 ml/h，持续60 min；假手术组:不夹闭右侧肾蒂，未予缺血处理，以等容生理盐水取代丙泊酚。各组分别设立三个时间观察点:缺血前15 min、再灌注2 h、再灌注24 h。每个时间点6只大鼠,各组大鼠存活至各自观察时间后再次麻醉自腹主动脉取血标本5 ml离心分离出血清，BUN、Cr分别用苦味酸法和二乙酰?肟法生化方法检测，采用相应试剂盒测定SOD、MDA，试剂盒购于南京建成生物医学工程研究所。同时摘取新鲜左肾下极置于10%中性甲醛溶液中固定24 h后常规石蜡包埋，按病理学常规制片HE染色，光学显微镜观察，观察肾组织损伤情况。

　　1.3  统计分析  计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 12.0统计软件处理，多组间均数比较用方差分析，两组间均数比较用t检验，P＜0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  肾组织病理改变  肉眼下：假手术组肾皮质髓质颜色正常；I/R组肾皮质较苍白，髓质颜色呈暗红色；丙泊酚预处理组肾皮质髓质颜色接近假手术组。光镜下：假手术组肾小球，肾小管结构正常；I/R组肾小管上皮细胞变性坏死,细胞脱落,肾小管管腔变窄,肾间质水肿、充血伴炎性细胞浸润明显；而丙泊酚预处理组以肾小管肿胀为主，个别呈坏死样改变，肾间质水肿、充血，炎性细胞浸润不明显。

　　2.2  丙泊酚对大鼠ARIRI所致血清BUN和Cr水平升高的影响  由表1可以看出，I/R组和丙泊酚预处理组复流后每个时间点血清BUN、Cr水平明显高于正常对照组(P<0.05)，再灌注后BUN、Cr水平均升高。但2 h和24 h无差异性(P＞0.05)。丙泊酚预处理组血浆BUN、Cr水平明显低于缺血再灌注组(P<0.05)。

　　表1  血清BUN、Cr含量变化情况（略）

　　注:与假手术组比较,①P＜0.05;与I/R组比较②P＜0.05;与术前比较,③P＜0.05

　　2.3  血清SOD和MDA值的变化  由表2可以看出，I/R组和丙泊酚预处理组复流后每个时间点血清MDA水平明显高于正常对照组(P<0.05)，再灌注后血MDA水平均升高，但2 h和24 h差异无显著性(P＞0.05)。I/R组和丙泊酚预处理组复流后每个时间点血清SOD水平和正常对照组差异无显著性(P＞0.05)。I/R组SOD水平明显低于正常对照组(P<0.05)，再灌注后血清SOD水平均降低，但2 h和24 h差异无显著性(P＞0.05)，丙泊酚预处理组血清SOD和MDA水平与I/R组均有统计学差异(P<0.05)。

　　表2  血清SOD、MDA含量变化情况（略）

　　注:与假手术组比较,①P＜0.05;与I/R组比较②P＜0.05;与术前比较,③P＜0.05

　　3  讨论

　　自Mccord［1］1985年提出IRI的概念后，许多学者陆续证实在多种组织、器官存在IRI。各种原因造成组织血液灌流量减少可使细胞发生缺血性损伤，恢复血液再灌注后，缺血性损伤进一步加重的现象称为IRI。近年来研究证实，IRI不仅引起器官功能恢复延迟，而且同时还间接影响免疫系统。肾脏是对IRI敏感的器官之一，临床上休克、播散性血管内凝血、肾脏外伤和肾脏移植中均可发生肾IRI。肾缺血在一定时间后恢复供血，可进一步加重肾脏损伤，其主要因素是再灌注后钙超载与自由基的爆发性产生，所致肾脏IRI，最终导致缺血性急性肾功能不全。

　　3.1  ARIRI损伤的机制  大量的研究证明,引起IRI的机制是多方面的，有氧自由基产生增加、细胞内钙超载、细胞因子的参与及中性粒细胞的聚集等。丙泊酚作为临床上常用的静脉麻醉药，其诱导迅速，苏醒完全，已证实有良好的抗氧化和抑制细胞因子释放的功能。丙泊酚的化学结构与内源性抗氧化剂a生育酚(维生素E)十分相似，其抗氧化作用的结构基础也正是这种类似的酚羟基结构。丙泊酚可直接与自由基反应生成2，6—二异丙基苯氧基因，使自由基灭活。丙泊酚主要的抗氧化机制是抑制自由基介导的脂质过氧化反应，同时丙泊酚良好的脂溶性使其更容易积聚在细胞的脂质双层膜上，从而提高细胞抗氧化能力。肾脏为高灌注器官，对缺血及再灌注均敏感，再灌注期氧自由基大量生成，超过自由基清除酶的清除力，使机体氧化、抗氧化失调，导致自由基的脂质过氧化损伤；缺血再灌注肾细胞呈现Ca超载，与肾细胞凋亡率呈正相关趋势，提示肾细胞钙超载可能是再灌注损伤肾功能障碍的重要原因［2］。钙超载可引起严重的肾小管上皮细胞损伤，其发生是由于再灌注期大量的钙内流造成的，钙内流增加可损伤线粒体的氧化磷酸化作用，影响ATP合成，引起蛋白质分解和膜破坏促进自由基的生成。目前越来越多的实验研究证实是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着IRI。Lisa等［3］认为,线粒体钙超载产生再灌注损伤的机制之一就是线粒体基质钙浓度升高，使线粒体内膜一种渗透性运转孔道开放，干扰线粒体的产能。线粒体基质钙超载是这种非特异性孔道开放的重要原因，静脉麻醉药丙泊酚具有抑制这种非特异性孔道开放的能力［4］。

　　3．2  丙泊酚对大鼠ARIRI所致血清BUN和Cr水平升高的影响  IRI时肾细胞膜受损，细胞膜屏障作用减弱，细胞内各种酶释出，BUN、Cr 释放量能够密切反映肾细胞的受损情况。本研究显示：缺血再灌注后BUN、Cr 明显升高，丙泊酚组升高轻于缺血再灌注组,差异有显著性，说明丙泊酚的抗氧化作用保护了肾细胞膜，减轻了酶释出。总之，丙泊酚对肾I/ R 中的肾脏损伤有显著的保护作用，能改善肾功能，保护肾脏结构。而对于丙泊酚预处理最佳方案如最佳时机、最佳浓度等以及其对肾的各种保护机制的内在联系还有待于进一步研究。

　　3.3  丙泊酚对大鼠ARIRI所致血清SOD和MDA水平的影响  SOD是自由基的重要清除酶之一，其活性可反映机体对氧自由基清除能力的高低。MDA是脂质过氧化的最终产物，测定MDA可直接反映自由基水平，其含量高低是组织细胞损伤的重要标志。研究发现［5］丙泊酚具有良好的抗过氧化作用，能明显地降低主动脉阻断及再灌注后MDA产量，保护SOD活性。机体为了对抗I/R损伤，激活SOD清除体内多余的氧自由基，维持内环境稳定。从本实验可以看出SOD在缺血前活性最强，再灌注后2 h明显降低，表明SOD也参与了ARIRI的病理过程。我们认为，SOD活性的下降与其清除氧自由基时的消耗有关。本实验结果显示：肾缺血及再灌注期血中MDA含量显著升高，SOD含量降低，表明缺血再灌注后氧自由基产生。机体清除氧自由基能力降低，导致脂质和蛋白质过氧化，尤其使胞膜上多价不饱和脂肪酸过氧化，脂肪酸过氧化可生成MDA，它的生成与脂质过氧化相平行，损伤的细胞膜和细胞器膜，可导致组织结构和功能受损，我们的结果与相关是一致的［6］。本研究结果表明：临床麻醉剂量的丙泊酚能减轻氧自由基释放导致的组织脂质过氧化反应。丙泊酚有抗氧化作用，这可能是丙泊酚减轻肾缺血?再灌注损伤的机制之一。综上所述，丙泊酚预处理对肾脏IRI有抗氧化保护作用，对防治IRI的应用具有重要的研究意义，并且为加强肾脏保护提供理论依据。不仅在临床肾脏IRI，而且在器官移植手术中探讨丙泊酚预处理对肾脏IRI的抗氧化保护作用具有现实意义。

【文献】
  　　［1］ Mccord JM. Oxygen derived free radicals in postisehemic tissue injury［J］.N E J Mel,1985,312(3):159.

　　［2］ 傅耀文，张文岚，薛立娟.缺血再灌注对肾细胞内钙水平［J］.中华泌尿外科杂志，2004,25(12):834?837.

　　［3］ Lisa FD, Bkernardi P. Miochondrial function as a determinant of recovery or death in cell response to injury［J］.Mol Cell Biochem,1998,184:379?391.

　　［4］ Javadov SA,Lim KH,Kerr PM,et al. protection of hearts from reperfusion injury by propofol is associated with inhibition of the mitochondrial permeability transition［J］.Cardiovasc Res,2000,45:360?369.

　　［5］ 王泽华，殷振奎，黄海波，等.丙泊酚对急性肾缺血再灌注过程脂质过氧化损伤的保护作用［J］.临床麻醉学杂志，2001,17(11):619?621.

　　［6］ 王丽，梅长林. 缺血诱导因子1a及氧自由基在肾缺血再灌注损伤中的表达［J］.中华肾脏病杂志，2006,22(6):371?373.