凋亡调控因子Survivin和Caspase3蛋白在宫颈鳞癌中的表达及意义
【摘要】 目的：探讨宫颈鳞状细胞癌中凋亡凋控因子Survivin和Caspase?3蛋白的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学技术检测40例宫颈鳞状细胞癌及10例正常宫颈组织中Survivin 和Caspase?3的表达水平。 结果：Survivin蛋白在宫颈鳞状细胞癌中表达水平高于正常宫颈组织(P<0.05)。Caspase?3表达水平低于正常宫颈组织(P<0.05)。Survivin和Caspase?3蛋白的表达水平在不同分化程度的宫颈癌之间的差异有显著意义(P<0.05)。结论：宫颈鳞状细胞癌的发生、与Survivin 和Caspase?3蛋白的异常表达有关，可能是细胞异常增殖和凋亡失衡的结果。
【关键词】 宫颈 鳞状细胞癌 Survivin；Caspase?3 p63；bak 免疫组化 表达 意义
Expression and Significance of Regulators and Effector of Survivin and Caspase?3 in Cervical Squamous Cell Carcinomas
LI Hai,DENG Zhi?yong,CHEN Jin?zhen，ZHENG Xiao?juan,ZHANG Yang,XU Song
The First People’s Hospital of Kunshan, Kunshan, Jiangsu 215300, China.
Abstract: Objective To investigate the expression and significance of regulators and effector of Survivin and Caspase?3 in cervical squamous cell carcinomas.Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression of regulators and effector of Survivin and Caspase?3 in 40 cases of cervical squamous cell carcinomas, 10 normal cervical tissues.Results Expression of Survivin were observed in cervical carcinomas, that is higher levels in cervical carcinomas than in normal cervical tissues (P<0.05), and Caspase?3 is lower levels in cervical carcinomas than in normal cervical tissues (P<0.05).Significant differences were observed for Survivin and Caspase?3 expression levels in different differentiated cervical carcinoma(P<0.05).Conclusion The abnormal expression of Survivin and Caspase?3 may be a positive factor in the pathogenesis of cervical squamous cell carcinomas .The results suggest that cervical squamous cell carcinomas may result from abnormal preliferation and unbalanced apoptosis.
Key words:Cervical；Squamous cell carcinomas；Survivin；Caspase?3；p63；Bak; Immunohistochemistry；Expression；Significance
目前对宫颈癌的发生、发展已进行多方面的研究, Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的一个新成员, 是迄今发现最强的凋亡抑制因子。可直接抑制Caspase?3 和Caspase-7 的活性,从而阻断细胞的凋亡过程。具有抑制凋亡效应蛋白酶Caspase 活性、参与细胞周期调控及调节细胞有丝分裂等多种生物学作用［1，2］。细胞凋亡的异常与肿瘤发生发展密切相关,而Caspase?3 在凋亡过程中起着重要的作用。为此, 我们应用免疫组织化学方法检测宫颈鳞癌组织中Surviving 及Caspase?3蛋白的表达,以探讨其在宫颈癌中的表达和意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象
标本取自本院病理科2004年至2007年期间活检或手术宫颈鳞癌标本,共计40例,同时选正常宫颈组织10例作为对照。年龄30岁～59 岁,平均年龄41岁。其中高分化鳞癌22例,低分化鳞癌18例。
1.2 研究方法
宫颈标本均经10%的甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚4 μm～5 μm，载玻片经多聚赖氨酸处理，防止脱片。微波抗原修复。兔抗人Caspase?3多克隆抗体，兔抗人Survivin 多克隆抗体，免疫组化试剂盒、DAB显色剂试剂盒均购自福州迈新公司。染色步骤按试剂盒说明书操作。PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明，树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。光镜下任取4个高倍视野进行细胞计数，至少计数200个细胞，免疫组化染色阳性为棕黄色颗粒定位于细胞浆或细胞核,阳性细胞数为0 记做( - ) ,阳性细胞数占肿瘤细胞总数25 %以下为( + ) , 25 %～ 50%为( + + ) ,>50 %为( + + + ) 。
1.3 统计方法
使用Stata 4.0统计软件，采用χ2检验，P值显著性取＜0.05。
2 结果
2.1 Survivin、Caspase?3 在宫颈鳞癌和正常宫颈组织中的表达
Survivin 蛋白阳性表达呈棕黄色,颗粒状,主要定位于肿瘤细胞胞浆中,偶见于胞核。40例宫颈鳞癌中有29 例Survivin 呈阳性表达,10 例正常宫颈组织无阳性表达, 上述各组之间的阳性表达率的差异有显著意义(P<0.05) 。Caspase?3蛋白阳性表达呈棕黄色,颗粒状，主要定位于细胞浆中,少数定位于细胞核中。40例宫颈癌组中14例Caspase?3例呈阳性表达,10例正常宫颈组织中8例呈阳性表达, 上述各组之间的阳性表达率的差异有显著意义(P<0.05)，见表1。表1 Survivin、Caspase?3在宫颈鳞癌和正常宫颈组织中表达（略）
上表提示：宫颈鳞癌中Survivin蛋白表达较正常宫颈组织明显升高，差异有显著性（P<0.05）。宫颈鳞癌中Caspase?3蛋白表达较正常宫颈组织明显降低，差异有显著性（P<0.05）。
2.2 Survivin、Caspase?3 在宫颈鳞癌中的表达
随着肿瘤分化程度的降低，宫颈低分化鳞癌组Survivin蛋白的阳性表达明显升高，各组之间阳性表达率的差异有显著意义( P < 0.05) 。而随着肿瘤分化程度的降低，宫颈低分化鳞癌组Caspase?3蛋白的阳性表达明显降低，差异有显著性（P<0.05）， 见表2。表2 Survivin、Caspase?3与宫颈鳞癌病理分级的关系（略）
上表提示：随着肿瘤分化程度的降低，宫颈鳞癌中Survivin蛋白的阳性表达升高，差异有显著性（P<0.05）。而随着肿瘤分化程度的降低，宫颈鳞癌中 Caspase?3蛋白的阳性表达降低，差异有显著性（P<0.05）。
3 讨论
Survivin 基因是一类结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白［1］， 在调控细胞周期和抑制细胞凋亡中起重要作用, 通过直接阻断Caspase?3 和Caspase?7的效应、抑制多聚ADP核糖聚合酶和阻止P 21等的抑制, 从而抑制细胞凋亡, 有利于细胞的异常增殖和恶性转化,是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子。作为凋亡抑制基因家族中的重要成员, Survivin基因在正常组织中不表达或低表达,而在几乎所有被研究的肿瘤组织中呈高表达［2］，这一特点使其可能成为判断肿瘤患者预后及辅助肿瘤诊断的一项重要指标,也为肿瘤的诊断和提供了新的靶点。
本研究结果显示, Survivin蛋白定位于细胞浆和胞核,在宫颈鳞癌中的表达率为72.5%,而在正常宫颈组织中无阳性表达（P<0.05）。显示Survivin 基因在宫颈鳞癌中表达上调,细胞生长和凋亡途径的紊乱则有利于肿瘤的生长和侵袭。宫颈癌组织中Survivin基因的异常表达，可能直接促进细胞逃离正常的监控机制,即通过抑制恶性细胞凋亡,促进细胞异常增殖,参与宫颈鳞癌的发生、发展,因此 Survivin 是一个有潜在价值的肿瘤标志物。本研究结果同时显示，Survivin 蛋白的表达水平与肿瘤的分化程度有关,在不同组织学类型中其表达是不一样的,肿瘤分化程度越低, Survivin 蛋白阳性表达率愈高,与王梅等［3］在宫颈癌检测的结果基本一致。提示在肿瘤组织中的Survivin 蛋白能够抑制正常的细胞凋亡过程，使癌细胞获得永生性（immortality）。Survivin 蛋白在肿瘤细胞中的表达越高，其对癌细胞凋亡抑制能力越强，癌细胞的生存能力和肿瘤的恶性程度也随之增高，癌细胞更容易侵袭周围组织并发生转移，导致患者的生存期缩短，即Survivin 蛋白的高表达预示宫颈鳞癌患者预后不良。由于宫颈鳞癌的发生可以视为肿瘤细胞增殖活跃以及凋亡抑制，打破了细胞增殖与死亡的动态平衡，从而导致细胞的无限增殖与恶性转化所致。Survivin 蛋白的表达进一步扩大了细胞增殖与凋亡之间的差距，使肿瘤细胞获得了生长优势。
由于Survivin蛋白仅特异性地表达于肿瘤组织，在正常人体组织几乎不表达，使得应用蛋白特异性抗体免疫以及反义基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性。由于Survivin蛋白在宫颈鳞癌的生长过程中发挥了重要作用，故Survivin蛋白的表达可以作为预后不良的重要指标，也可能成为治疗宫颈鳞癌的一个新靶点。设法阻断Survivin蛋白的表达，可能会发挥抑制宫颈鳞癌细胞生长的作用，从而促进肿瘤细胞的凋亡,将有利于肿瘤的治疗,从而达到治疗宫颈鳞癌的目的，为宫颈鳞癌的治疗提供了新的思路。
细胞凋亡是一种基因控制的细胞主动死亡过程,正常组织的细胞处于不断增殖和不断凋亡的动态平衡状态中,一旦细胞调节紊乱,两者失衡,则可发生肿瘤。凋亡抑制蛋白阻断细胞凋亡的途径,是通过直接作用于细胞凋亡途中的终末效应酶?半胱氨酸蛋白酶caspase?3、caspase?7起作用的,而caspase是细胞凋亡的核心,一旦caspase功能受到抑制,DNA受损,细胞则会无限增殖,继而形成肿瘤。
Caspase?3是Caspase家族中的最重的成员［4］。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件,它的激活与超常表达均引起细胞凋亡,因此又称死亡蛋白酶,它们通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡［5］ 。Caspase?3是细胞凋亡过程中的主要效应因子［6］。效应Caspase主要负责切割某些蛋白质。其对底物作用引起的变化包括: 引起细胞周期阻滞；破坏细胞平衡状态及修复机制；使细胞从周围的组织结构中脱落；使维持细胞结构的物质解体。大多数触发细胞凋亡的因素,最终均需要通过Caspase?3介导的信号传递途径导致细胞凋亡。在已发现的14个家族成员中, Caspase?3处于凋亡有序级联反应的下游,是最重要的效应型Caspase。Caspase?3可通过Fas介导的死亡信号途径,被Caspase家族上游成员激活并水解为活性酶形式,进而裂解细胞的关键结构蛋白和看家蛋白,导致细胞凋亡［7］。
许多学者研究发现:Caspase?3在肿瘤,如胃癌［8］、前列腺癌［9］、乳腺癌［10］等中表达量较正常明显降低。本研究结果显示, 在正常宫颈中Caspase?3的阳性表达为80％,caspase?3在宫颈癌组织中的阳性表达率明显低于在正常宫颈组织，(P<0.05)。Caspase?3在宫颈癌中的表达与组织分化程度相关,随着宫颈鳞癌分化程度的降低，Caspase?3蛋白的阳性表达降低，差异有显著性（P<0.05）。提示Caspase?3在正常宫颈组织中表达加强，可促进异常增生细胞凋亡，进而拮抗细胞的增殖,维持细胞数目的稳定。但是随着癌变的发生，细胞增殖速度的增加,异常增生的细胞中绝对凋亡率开始降低,异常增生细胞不断累积,预示着上皮异常增生的高度危险性。结果显示，随着鳞癌的发生，以及癌肿分化程度的逐步降低，Caspase?3的表达强度明显逐步减弱。可能是此期Caspase?3的生物合成已受到某些因素影响,再不能正常发挥促进细胞凋亡的作用。由于Caspase?3表达强度在高分化组明显高于低分化组,提示癌细胞分化程度高,细胞凋亡调控机制障碍程度轻,癌细胞增殖较弱,患者预后较好。
宫颈癌的发生如同其他的恶性肿瘤一样,是多基因调控的复杂过程。Survivin 及Caspase?3基因蛋白在宫颈鳞癌组织中的再激活和异常表达，对宫颈鳞癌的诊断及预后具有重要价值, 针对Survivin 的靶向联合治疗可能会成为宫颈癌的有效治疗方法之一。我们期望通过扩大样本量,进行多变量分析和研究,寻找宫颈癌发生的生物学特性,从而揭示其发生、的,为宫颈癌的预防、早期诊断和有效治疗开辟新天地。
【参考】
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