端粒酶含量测定在宫颈癌发展及预后中的意义
【摘要】 目的：检测宫颈上皮内瘤样病变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）及各期宫颈癌组织中端粒酶的含量，探讨端粒酶含量改变作为宫颈癌的早期诊断，及术后复发依据的可能性。方法：采用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）间接荧光标记法对端粒酶进行标记后，流式细胞仪进行定量检测。以端粒酶表达率及端粒酶表达的荧光指数为指标进行统计学分析。以正常宫颈组织为对照。结果：端粒酶表达的百分率及荧光指数两指标在宫颈浸润癌，CIN及正常对照的组间差异显著，且有渐减； 宫颈癌不同期别的组间差异显著。 结论：端粒酶含量在癌前病变中已表现出显著升高,且其含量随肿瘤的而进行性升高,因此,端粒酶的定量检测有可能成为宫颈上皮内瘤样病变进展及宫颈癌预后判断的辅助指标。
【关键词】 宫颈上皮内瘤样病变 宫颈癌 端粒酶
端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，是一种特殊的逆转录酶，当其激活时，能以其自身RNA为模板合成端粒DNA，以补充细胞分裂时端粒的缩短，导致细胞无限增殖。越来越多的研究证明，端粒酶为目前已知最为广谱的恶性肿瘤的分子标记物，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。本文试图通过对正常宫颈及宫颈上皮内瘤样病变（CIN），宫颈浸润癌组织端粒酶含量的检测，寻找端粒酶作为肿瘤进展指标的依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
正常宫颈12例（子宫良性病变而切除子宫者），CINⅠ23例，CⅡ16例，CINⅢ12例(其中原位癌6例)，浸润癌30例（鳞癌25例，腺癌5例）。
1.2 方法
1.2.1 标本组织单细胞悬液的制备
取宫颈组织0.1 g～0.3 g,置于重叠的100目铜网及300目尼龙网上，切成0.5 mm3碎块，以眼科镊持碎块在网上轻搓，边搓边以PBS缓冲液将搓下的细胞冲洗入置于网下方的平面皿中，直至将组织搓完。收集细胞悬液于10 ml离心管中，离心半径8 cm，以800 r/min离心5 min，以2 ml PBS液漂洗，再以1 500 r/min离心5 min，弃上清液，调整细胞数为2×106/ml左右。4℃保存待检。
1.2.2 荧光单克隆抗体分子探针免疫学标记
采用间接免疫荧光标记方法。先以70%乙醇给细胞打孔，10 min后以0.01 MPBS缓冲液洗涤2次，将细胞均分为2管，1管作试验管，1管作免疫阴性对照管，调整细胞数为106个。试验试管中加入一抗（即抗端粒酶抗体，为兔抗人单克隆抗体，由北京岳泰公司提供）20 μl（工作液1：50），然后在56℃水中温浴30 min，PBS缓冲液洗涤2次，弃上清，试管中加入二抗（即为异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔抗体，由北京岳泰公司提供）20 μl（工作液1：50），56℃水中温浴30 min ，PBS缓冲液洗涤2次，弃上清，即可上机。免疫阴性对照管试管加入抗体为IgG1?FITC，为美国BD公司生产，由深圳晶美公司提供。
1.2.3 流式细胞仪检测
应用FACScan型流式细胞仪（美国BD公司生产），每支试管样品收取104个细胞进行检验。
1.2.4 分析指标
端粒酶含量表达的百分率为阳性区表达端粒酶含量的细胞数占所检验总细胞数的百分比（阴性区为阴性对照试管细胞所在区域，阳性区即为阴性区以外，一般分界取在荧光道数为10道上）。表达端粒酶相对含量的荧光指数为试验管与阴性对照管的平均荧光强度的差值与阴性对照管的平均荧光强度的比值。
1.3 统计学分析
采用Cellquest PLot处理软件（美国BD公司生产）分析结果。采用χ2检验。
2 结果
在CIN组中荧光指数值1.33±0.07,端粒酶的阳性表达率为(27.00±0.40)%,恶性肿瘤组中荧光指数值为1.87±0.08,端粒酶的阳性表达率为(80.20±0.85)%,组间差异有显著性(P<0.05)，见表1。表1 各组端粒酶含量的定量表达(略)
各组内的各指标因病理改变不同而存在显著性差异（P<0.05,表2），显示出端粒酶的阳性表达率自宫颈非典型增生开始，已有不同程度表达，至宫颈癌时明显增高，且随着病变的加重而有梯度增高。表2 各病变组的端粒酶含量的定量表达(略)
3 讨论
宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤。无限增值是癌细胞的重要生物学特性，也是肿瘤难以治愈的原因之一。由于端粒酶的激活可导致细胞永生化，使得端粒酶与肿瘤的发生发展之间形成了一种必然的内在联系。Zhang等在体外宫颈癌发生模型研究表明，端粒酶活化在细胞永生化阶段即出现，在宫颈癌变过程中持续存在，与宫颈癌的发生发展密切相关。
本研究即通过对癌前病变及癌变各分期组织的端粒酶含量的检测，发现端粒酶含量在癌变早期即有不同程度表达，且与正常组织存在显著性差异，这说明端粒酶含量的检测可以用来作为宫颈癌早期诊断的一个指标。该结果与有关端粒酶活性检测结果的报道一致。另宫颈癌变各分期间端粒酶含量亦存在显著性差异，且其表达程度随肿瘤的发展而进行性递增，说明端粒酶维持癌细胞无限增值的能力逐步增强，这与恶性度越高，增值越活跃的性质相符，临床表现也加重。这说明端粒酶含量的检测数值的高低可以监测肿瘤的发展及复发。
王冬等研究也发现宫颈癌组织无或有淋巴结转移，其端粒酶活性阳性表达率分别为69.70%、94.74%，两者之间比较差异有显著性（P＜0.05），所以端粒酶活性在宫颈癌组织中增高且与淋巴结转移相关。提示端粒酶在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用，对宫颈癌的早期诊断及癌变预测具有重要意义。也提示端粒酶含量检测是肿瘤进展及恶性程度的一个全新标志。
总之，通过以上实验，我们认为端粒酶含量不仅可以用于宫颈癌的早期诊断，而且可以用来评估宫颈癌预后。
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