免疫沉淀法分离血清APO?B在慢性丙型肝炎与脂代谢研究中的应用
作者：李泽孟，蒋文英，张劲，魏荣，朱建宏，杨璐，焦娇
【摘要】 目的：为研究西安地区慢性丙型肝炎(HCV)感染与脂代谢关系而探讨脂质简便分离技术的可行性。 方法：以羊抗人APO?B抗血清沉淀并分离HCV抗体阳性者血清APO?B，再以PCR技术进行扩增检测APO?B中HCV?RNA，并作血清HCV?RNA检测及HCV抗体阴性组对照。结果：在HCV抗体阳性者血清APO?B实验组中，检出了HCV?RNA，且拷贝数占血清中HCV?RNA的较大比率(4.74% ~ 27%)，而各对照组中没有HCV?RNA表达。结论：免疫沉淀法分离血清APO?B的实验方法是一项传统的成熟技术，操作方便稳定可靠，实验结果进一步支持和证实了HCV与LDL结合的密切关系。
【关键词】 免疫沉淀法；羊抗人APO?B血清；聚合酶链反应PCR技术；HCV?RNA；脂质代谢
近年来，HCV感染慢性化后肝脂肪变性的问题在临床普遍予以重视。因此，医学界人士对HCV感染与脂肪代谢的关系进行了很多的研究。国外学者Thomssen 等人［1］用梯度离心法和免疫沉淀法发现HCV－RNA与LDL结合的组分可被抗β脂蛋白抗体共同沉淀。Prince等［2］注意到了高度感染性血清中的HCV与LDL的结合具有特殊的亲和力，利用柱层析技术将含有HCV的血清进行分离后，以PCR技术进行扩增检测得到证实。为探讨西安地区慢性丙型肝炎（以下简称丙肝）患者HCV感染与脂类代谢的关系及特点，笔者选用免疫沉淀技术，用羊抗人APO?B血清从HCV抗体阳性者血清中分离获得载脂蛋白B（APO?B），再以逆转录聚合酶链反应（RT PCR）技术进行扩增检测HCV?RNA，并与对照组比较分析，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 用于沉淀慢性丙肝患者血清APO的羊抗人APO?B抗血清及pH 7.5磷酸盐缓冲液，由上海科华生物科技公司提供，其质量检验应用日立7170 A全自动生化仪；HCV?RNA检测试剂由广州达安生物科技公司提供；PCR仪为美国PE 5700型实时荧光定量分析仪；实验用HCV抗体阳性血清来自本院门诊和住院确诊病例的自愿者；对照组用慢性乙型肝炎患者血清（HBV1.4.5项阳性）来自本院门诊的确诊病例。均于晨空腹抽血备用。
1.2 方法
1.2.1 羊抗人APO?B抗血清重现性、准确性、线性检测 用无溶血、无黄疸、无脂血的新鲜血清样品，作APO?B测定20次，各均数及变异系数，结果：X(8/L)0.71、1.12；S(8/L)0.02、0.03；CV(8/L)2.82、2.68。另以科华公司的APO?B定标液制定标准曲线后，分别测定Precinoim和Precipath 3次取其均数，与定标、测定值比较，结果：标定值0.95、1.59；测定值0.92(97.3%)、1.46(91.8%)，准确性偏差<10%。线性检测参照Albers等所述的方法进行，取APO?B量较高的样品，分别按照各测定条件，取得各自测定值，再作不同比例稀释（30％～90％），原测定值与稀释比例的乘积为预期值，从低浓度到高浓度反复连测3次，分别计算每一浓度测定值均数，再与预期值作比较。结果本批次羊抗人APO?B血清的回归方程Y=0.989X±0.052，r=1.000，线性范围为0.25 g/L～2.00 g/L。
1.2.2 HCV抗体阳性血清中APO?B的分离提取 取实验血清15 μl加磷酸盐缓冲液1.5 ml，置37 ℃孵育5 min再加入羊抗人APO?B 0.5 ml混匀，37 ℃孵育5 min制成APO?B悬液。以8 000 r/min高速低温离心15 min，去上清液，留取沉淀0.5 ml（APO?B），用于HCV?RNA检测。
1.2.3 APO?B中RNA的提取 于灭菌处理过的0.5 ml离心管中先加入10 μl RNA提取液A，然后加入上述提取物apo?B 100 μl，再加入200 μl的RNA提取液B，混匀，量室温5 min，8 000 r/min离心1 min，去上清后，用75%预冷乙醇，洗沉淀两次，65 ℃干燥沉淀10 min。
1.2.4 逆转录、PCR扩增及反应前、后荧光检测 严格按操作流程、步骤和试剂使用说明书进行上述样本的实验，并详细记录读数A1。
2 结果
HCV抗体阳性血清APO?B中及对照组中HCV?RNA检出情况，见表1。
表1 HCV抗体阳性血清APO?B及对照组中HCV?RNA检出情况（略）
3 讨论
免疫沉淀法是一项传统的成熟试验技术，对于抗血清的制备其质量要求较高，尤其对微量实验，要求在同一批号内的效价与亲和力要高，特异性与稳定性要好，方能保证实验的稳定可靠。本文所用免疫沉淀剂，是用纯化的人血浆APO?B免疫绵羊后获得的羊抗人APO?B抗血清，用它沉淀丙肝患者血清APO?B，作为HCV与脂代谢关系研究的实验检测方法，具有操作方便稳定可靠的特点。经与羊抗人APO?A1抗血清试验没有与其他APO交叉反应。本批次APO?B抗血清经质量监测，其重现性CV值<5%，准确性偏差<10%，线性范围0.25 g/L～2.00 g/L。免疫沉淀法分离血清APO?B的实验技术，是一种可信并可行的实验研究方法。较之柱沉析技术，该法在实验操作中更显方便和快捷，亦更适合于常规实验室操作。采用羊抗人APO?B抗血清沉淀分离的APO，其理化性质已很清楚，它主要由肝细胞合成，不仅是脂质运输和稳定的基础，同时还参与脂代谢相关酶类的激活及脂蛋白受体的识别。正常情况下，每个LDL、IDL、VLDL、LP(a)颗粒中均含有一分子APO?B100，LDL颗粒居多，且APO?B100又是APO?B的主要成分，大约90％的APO?B分布在LDL，它基本反映了LDL颗粒的多少，代表了LDL水平［3，4］，而APO?B100，具有合成装配和分泌富含甘油三酯的VLDL，是LDL的结构蛋白，同时也是LDL?R的配基，并可调节LDL从血浆中的清除速率。有研究发现［5］APO?B不仅能与LDL?R结合，还能与酸性乙酰基葡萄糖多聚体有很强的亲和力。这种蛋白质间的相互作用通常会引起原有分子的结构和理化性质的变化，很可能就是作为介导HCV与脂质关系或者介导肝细胞感染过程的一座桥梁，从而引起一系列肝细胞病理变化。本文采用羊抗人APO?B血清沉淀法和PCR技术，在HCV抗体阳性者血清APO?B中检出HCV?RNA，其拷贝数占血清中HCV?RNA检出量的较大比例(4.74％~27.00％)。进一步证实了HCV与脂质之间的结合及其关系。对继续研究西安地区HCV患者感染影响肝脏脂质代谢的机制以及和临床病程、预后等的相互关系，奠定了实验基础。
【】
［1］ Thomssen R， Bonk S， Thiele A. Med M icrobiol Immunol(Berl)，1993，182(6):329?334.
［2］ 李克.HCV与脂质关系的研究进展［J］.国外医学病毒学分册，2002，9(1)：1?3.
［3］ 吴茵杰，马小琪.生物化学及分子生物学［M］.出版社，2003：8.
［4］ Lothar Thomas，朱汉民.临床实验诊断学［M］.上海科学出版社，2004，5：140?150.
［5］ 刘明旭.HCV?R研究现状及展望［J］.中华肝脏病杂志，2002，(8)：311.
