凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间测定的问题

【摘要】  就目前玻片法凝血时间和Duke 氏出血时间测定已淘汰，迄今凝血试验中的凝血酶原时间 (PT) 和活化部分凝血活酶时间（ APTT) 测定已有公认的标准化方案，简要介绍此两种时间测定的方法、标本采集、注意事项、临床意义等。

【关键词】  凝血酶；时间测定；凝血活酶

　　血栓与止血实验室检查的临床重要性与日俱增， 检验内容不断扩大， 工作量也日益增多，不断出现方法更新和试剂商品化、操作自动化， 改变了以往靠手工操作、自配试剂、工作效率低的局面。过去的玻片法凝血时间和Duke 氏出血时间测定已淘汰，迄今凝血试验中的凝血酶原时间 (PT) 和活化部分凝血活酶时间(APTT)测定已有公认的标准化方案［1］，并成为实验室检查的常规项目。

　　1  玻片法凝血时间和 Duke 氏出血时间测定已淘汰

　　1.1  凝血时间  凝血时间是检测“内源”凝血系统相关因子缺陷的简易过筛试验。目前国内广泛使用的玻片法很不敏感，国外早在60年代即已淘汰。即使是被认为是较好的试管法，对第Ⅷ、第Ⅸ因子缺乏病例的阳性率也不高，而且操作繁琐。某些出血性疾病需要查凝血时间时，现已改用 APTT 代替［1］。

　　1.2  出血时间  出血时间是一种检测血小板数量、功能和毛细血管功能的过筛试验。目前我国临床常规实验室普遍采用的 Duke 氏法， 甚不敏感。少数出血性疾病， 例如血小板减少及功能异常及血管性血友病(vWD)等需要作BT时， 应采用出血时间测定器法 ( 改良的 Ivy法 )；后者要求患者在上臂缚压脉带， 充气并维持一定压力， 再用特制的刺血刀具 ( 目前这种刀具主要靠进口 )， 切一标准切口， 记录出血时间。操作繁琐、费时， 不能列为常规。该法影响因素很多，Crowl ey等列举的主要因素有 : 技术操作、切口的方向和部位、皮肤的温度和 Hct，特别是后者影响较大［2］。1991年LIND在《BLOOD》杂志上，发表了题为“出血时间不能预测外科出血”的文章［3］。1990年RODGERS和LEVIN也发表了文章， 认为出血时间要重新评价［4］。该二文收集了大量评价出血时间临床应用价值的资料， 认为这种方法 ( 包括出血时间测定器法 ) 对某些出血性疾病， 特别是用于手术前预测出血， 敏感性和特异性均不强。因此在外科术前不必将出血、凝血时间作为常规［1］。如果少数有出血史或出血体征， 需作该项检查时， 凝血时间改用 APTT， 出血时间用正规的出血时间测定器法。下面就简要介绍凝血酶原测定和部分活化凝血活酶测定的方法、原理和注意事项等［1］。

　　2  PT测定

　　2.1  原理  将凝血活酶和钙离子加到枸椽酸钠抗凝血浆中，37 ℃保温， 测定血浆凝固时间(PT) 。如果患者凝固时间延长， 表示血浆中缺乏 ( 或降低 ) 某一种或几种凝血因子。本法主要用于过筛检测外源凝血途径依赖维生素K的第Ⅱ、第Ⅶ、第Ⅹ因子。另外，第Ⅴ因子和纤维蛋白原缺乏以及存在相关因子的抑制物时，也可出现异常结果。

　　2.2  血液标本的采集、运送及贮存［1］  用一次性塑料采血器或硅化玻璃注射器采静脉血液；采血技术要熟练， 不可过多损伤血管及周围组织， 致使组织液混入血液中；采血时止血带不可束缚过紧， 并不应超过5 min；针筒内见到血即应解开止血带， 否则某些凝血及纤溶因子会活化，并可使红细胞比积 (Hct) 升高；血与枸椽酸钠抗凝剂按 9∶1混合， 轻轻颠倒混匀，防止不洁的试管和不合格橡皮塞的污染。贮血应用清洁塑料管或硅化玻璃管或其他不沾湿的容器， 避免接触活化凝血因子；取得血液后应尽快送到血液检验室。在运送中应避免剧烈振动和日光直射；一般要求自采血到测定不得超过4 h，不可久贮；如在室温中贮存过久，第Ⅴ因子会破坏;另一方面，在4 ℃贮存过久， 会导致第Ⅶ因子活化。实验室在取得血样后应尽快分离血浆并尽快测定；血液如发现凝固，应弃去不用。

　　2.3  标本制备  PT和APTT试验都必须用乏血小板血浆（PPP），分离血浆时要求相对离心力（2 000～2 500）Xg，离心30 min。用浊度法测定终点的自动化凝血仪，溶血和较明显的黄疸及脂血均会影响测定结果。

　　2.4  造成结果错误的原因［1］

　　2.4.1  与标本或样品有关的问题  血标本收集管注入血液过多或不足；患者红细胞比积>55% 时未校正枸椽酸盐液体积；用了非规定的抗凝剂 ( 如 EDTA或草酸盐 ) 或未加抗凝剂， 或抗凝剂浓度不准确；用了已凝固、溶血、黄疸或脂血样品；血标本混匀不当或剧烈的混匀；采血器或贮血管不洁， 已受到污染；污染了肝素。

　　2.4.2  分析前的问题  血标本送验延误或用了不合规定的容器和方法运送、处理或贮存血标本。

　　2.4.3  与试剂有关的问题  试剂己被污染；复溶时水或稀释剂加量不准确；复溶时未用规定的溶液；试剂在运输、贮存过程中由于处理不当而变质；试剂复溶后超过了规定的稳定期或试剂己超过有效期。

　　2.4.4  分析过程的错误  如保温时间不准确、温度、加试剂量以及操作步骤不准确等。

　　3  活化APTT推荐方法

　　APTT 是检测“内源” 途径凝血因子缺陷的过筛试验， 也是当前用于凝血因子、肝素抗凝治疗监控以及检测狼疮抗凝物 ( 一种抗磷脂自身抗体 ) 的主要手段。其临床应用频率仅次于 PT或与之相当。APTT 是从复钙时间和部分凝血活酶时间 (PTT) 改良而来。它用脑磷脂 ( 比 PT测定用的凝血活酶少了蛋白质部分， 故名部分凝血活酶 ) 作为血小板代替物，加到PPP中， 同时加入了活化第Ⅻ因子的激活剂。较之PTT， 其凝固时间缩短， 并且排除了血小板数量和功能对血浆凝固的影响。迄今为止，ICSH和ICTH尚未有 APTT 测定标准化或试剂标准化的方案， 仅NCCLS于1992年提出了一个编号H29?T的暂行规范［5］。以下是我国 APTT 测定标准化初步方案［1］。

　　3.1  原理  将一种脑磷脂 ( 血小板替代物，即部分凝血活酶 ) 和激活剂加到血浆中， 经过保温后，加入适当浓度的钙离子。其纤维蛋白凝块形成的时间 ( 以秒计 )，即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径和共同途径凝血因子的缺陷， 如因子Ⅻ、Ⅶ、Ⅸ、 Ⅺ、PK、HMWK 以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子的抑制物测定和肝素治疗的监控。

　　3.2  测定步骤

　　3.2.1  样品采集  样品的采取、贮存、运送与 PT测定相同。注意：应用清洁的塑料或硅化玻璃采血器采血及贮血， 防止凝血因子接触活化。

　　3.2.2  标本制备  标本 ( 乏血小板的血浆 ) 的制备与 PT相同。注意：必须用PPP测定。

　　3.2.3  温度  水浴箱或电热块的温度为 (37±1)℃， 要经常检查温度是否准确。

　　3.2.4  接触活化时间  加激活剂活化Ⅻ因子的时间要保持一致。各仪器和试剂生产厂家的规定可能不一样， 应严格按说明书要求进行。

　　3.2.5  操作  已预温(不超过30 min)的APTT试剂一份， 与预温(不超过10 min)的待测血浆一份混合，立即开动秒表计时。至规定的接触活化时间 ( 各商品要求不同 ) 终了时， 加入预温37 ℃的CaC12液一份，混匀，同时开动秒表。至出现血浆凝固时，停表记录血浆凝固时间(以秒计)。

　　4  PT和APTT的临床意义［7］

　　4.1  血浆PT测定  正常范围：正常PT为11 s～14 s，超过正常对照3 s为异常。临床意义：PT延长见于先天性因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ缺乏症和低或无纤维蛋白原血症；获得性见于DIC、肝病、阻塞性黄疸、维生素Ｋ缺乏症、血循环中有抗凝物质或口服避孕药等。PT缩短见于高凝状态和血栓性疾病。

　　4.2  活化APTT测定  正常参考范围：35 s～45 s，临床意义：APTT较正常对照延长10 s以上有意义。本试验较CT敏感，凡参与血浆凝血活酶生成的各种因子缺乏时，均可引起APTT延长，尤其Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ因子含量减少所致的各种血友病时多见延长，能检出因子Ⅷ：C＜２５％的轻型血友病。凝血酶原、纤维蛋白原严重减少以及有抗凝物质存在时亦可延长。也可作为血友病和抗凝药物治疗过程中的观察指标之一。APTT缩短见于DIC高凝期、血小板增多症等。

　　5  活化的APTT和血浆PT可见下列4种情况［6］

　　5.1  APTT和PT都正常  除正常人外，仅见于遗传性和继发性因子Ⅹ、Ⅲ缺乏症。获得性者常由于严重肝脏疾病、肝脏肿瘤、恶性淋巴瘤、包括白血病、抗因子Ⅹ、Ⅲ抗体、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血等引起。

　　5.2  APTT延长伴PT正常  多数是由于内源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病，如血友病A、血友病B、因子Ⅺ缺陷症；血循环中有抗因子Ⅷ、抗因子Ⅸ或抗因子Ⅺ抗体存在；DIC时可见因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ减低，肝脏疾病时可见因子Ⅸ、Ⅺ减少，口服抗凝剂时可见因子Ⅸ减低、vWD等。

　　5.3  APTT正常伴PT延长  多数是由于外源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅶ缺陷症，获得性者常见于肝脏疾病、DIC、血循环中有抗因子Ⅶ抗体存在和口服抗凝剂等。

　　5.4  APTT和PT都延长  多数是由于共同途径凝血缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅹ、Ⅴ、凝血酶原（因子Ⅱ）和纤维蛋白原（因子Ⅰ）缺陷症，获得性者主要见于肝脏疾病和DIC，口服抗凝剂时可有因子Ⅹ和凝血酶原减低。此外，血循环中有抗因子Ⅹ、抗因子Ⅴ和抗因子Ⅱ抗体存在时，它们也相应地延长。临床应用肝素治疗时，APTT和PT也都会延长。

【参考】
  　　［1］ 朱忠勇.凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间测定标准化［J］.中华医学检验杂志，1998，21(5)：308?312.

　　［2］ Crowly JP，Metzger JB，Valeri CR.TheVolume of Blood Shed During the Bleeding Time Correlates with the Peripheral Venous Hematocrit.Am J Clin Pathol，1997，108:579?584.

　　［3］ Lind SE.The Bleeding Time Does Not Predict Surgical Bleeding.Blood，1991，77:2547?2552.

　　［4］ Rodgers RPC，Levin J. A Critical Reappraisal of the Bleeding Time .Semin Thromb Haemost，1990，16:1?20.

　　［5］ NCCLS.Document H29?T(tentativeguideline).Activated Partial Thromboplastin Test(APTT)，1992，12：22.

　　［6］ 王鸿利.出血的实验诊断［J］.上海第二医科大学瑞金上海血液学研究所.

　　［7］ 杨春生，宋乃国.临床检验学［M］.天津技术出版社，1998，(1)：39?43.