藤黄菌素对人白血病细胞系HL60体外增殖的影响

                   作者：陈伟珠，林小聪，刘新光

【关键词】  藤黄菌素；白血病细胞系；增殖；细胞周期

　　［摘要］目的：观察藤黄菌素对HL60细胞体外增殖的抑制作用及其对细胞周期的影响。方法：分别采用台盘蓝拒染法及流式细胞术，在不同条件下测定细胞增殖的抑制率及细胞周期的分布。结果：应用台盘蓝拒染法，藤黄菌素能够显著地抑制HL60细胞的体外增殖并且呈现时效及量效关系。流式细胞术的结果表明：藤黄菌素作用2 h可使HL60细胞的细胞周期分别阻滞于G2/M期和G0/G1期。结论：藤黄菌素能够明显抑制HL60细胞体外增殖。

　　［关键词］ 藤黄菌素；白血病细胞系；增殖；细胞周期

　　Effect of Luteolin on Proliferation of Human Leukemic Cell HL60 in Vitro

　　Abstract:Objective To observed the influence of luteolin on proliferation and cell cycle of human leukemic cell HL60 in vitro.Methods The cell growth was tested by trypan blue stain assay and the cell cycle was analysed by flow cytometry in the various conditions.Results Using the trypan blue stain assay we found that luteolin inhibited the proliferation of HL60 cell strongly,the higher dose and/or the longer time,the more obvious effects.Flow cytometry analysis showed that luteolin could arrest cell cycle progression in G2/M and G0/G1 phase in two hours,respectively.Conclusion luteolin is an effective flavonoid compound which can notably inhibit the proliferation and cell cycle of HL60 cell in vitro.

　　Key words:Luteolin;Leukemic cell;Proliferation;Cell cycle

　　藤黄菌素（结构式见图1）是从龙胆科植物湿生蕾中所提取的一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学和药学作用［1,2］。许多研究表明藤黄菌素对多种肿瘤细胞均有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌以及黑色素瘤等［1,3,4］。为此，本实验选用藤黄菌素研究其对HL60细胞体外增殖及细胞周期的影响，为进一步探讨黄酮类化合物在体内的抗癌作用机制提供实验依据。藤黄菌素（3',4',5,7四羟基黄酮）

　　1材料与方法

　　1．1　材料

　　1．1．1　试剂　　

　　藤黄菌素为Sigma公司产品，纯度99%。RPMI1640培养基为Gibco公司产品。超级新生牛血清购自杭州四季青公司。二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF) 为Amresco公司产品。十二烷基硫酸钠(SDS)为Biomol公司生产。四噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品。其他所用试剂均为国产分析纯试剂。

　　1．1．2　仪器　　

　　美国Precision公司生产的La5410型CO2孵箱，美国BioRad公司生产的450型酶标免疫测定仪,美国Coulter公司生产的EpicsX2型流式细胞仪。

　　1．1．3　细胞系　　

　　人早幼粒细胞白血病HL60细胞系购自院上海细胞生物所。

　　1．2　方法

　　1．2．1　细胞培养　　

　　人早幼粒细胞白血病HL60细胞系培养于含有10%灭活的超级新生牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱中孵育。

　　1．2．2　台盘蓝拒染法检测细胞增殖　　

　　取对数生长期的HL60细胞，调整细胞浓度为1.0×105/ml～2.0×105/ml，直接加入24孔板，每孔1 ml，用药组加入1 μl不同浓度的药物，每组设3个平行孔，并设对照孔。细胞加药后置于37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱中孵育，然后按1∶10（V/V）加入0.4%的台盘蓝，染色2 min～3 min，在光学显微镜下做活细胞记数。药物对细胞增殖的抑制率(IR)按照公式：IR=（1-用药组平均活细胞数/对照组平均活细胞数）×10%。半抑制浓度(IC50)的计算根据半数效量概率单位法进行。以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标，求出直线回归方程，并根据方程计算IC50值(50%抑制时的概率单位为5)。

　　1．2．3　流式细胞术检测细胞周期　　

　　收集HL60细胞，调整细胞浓度为0.5×106/ml～1.0×106/ml，分装于6孔板中，每孔1 ml，用药组加入1 μl不同浓度的药物，每组设3个平行孔，并设对照孔。细胞加药后37 ℃、5% CO2保温2 h。1 000 r/min离心5 min收集细胞。PBS洗1次后，在沉淀中加入冰预冷的70%乙醇4 ℃固定12 h以上。上机前1 000 r/min离心5 min，弃固定液，再用PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI)染液500 μl（含50 μg/ml PI，100 μg/ml Rnase A），室温于避光处染色30 min。经100目尼龙网过滤后，在流式细胞仪上测定DNA的含量，计算细胞周期的百分比。

　　1．2．4　统计学处理　　

　　以SPSS 11.0软件做统计学数据处理，实验结果用±s表示，多组资料采用oneway ANOVA分析，组间的比较用Dunnett's检验，P＜0.05差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2．1　台盘蓝拒染法检测藤黄菌素对HL60细胞体外增殖的影响　　选取不同的时间，应用台盘蓝拒染法对藤黄菌素作用后HL60细胞的体外生长作连续的时效以及量效观察。实验结果（见表1）表明：10 μmol/L～80 μmol/L的藤黄菌素作用后，HL60细胞的体外增殖受到明显的抑制；当时间不变时，随着用药剂量的增大，对HL60细胞的抑制作用增强，且呈现剂量依赖性；在同一药物浓度情况下，随着药物作用时间的延长，药物对细胞增殖的抑制作用增强，呈现时间依赖性。表2显示了此药物作用于HL60细胞的半抑制浓度（IC50）。表1台盘蓝拒染法检测藤黄菌素对于HL60细胞的抑制率(略)注：n=3，各组与对照组相比**P＜0.01。表2　台盼蓝拒染法检测藤黄菌素对HL60细胞增殖抑制作用的IC50值药物IC50（略）

　　2．2　藤黄菌素作用2 h对HL60细胞细胞周期的影响　　

　　分别用不同浓度的藤黄菌素作用于HL60细胞2 h，然后收集各组细胞以流式细胞仪检测DNA的含量。结果表明：HL60细胞细胞周期G2/M期的比例增加，S期的比例降低，而G0/G1期的比例则无明显的变化（结果见图2和表3）。这说明了藤黄菌素作用2 h可使HL60细胞的细胞周期阻滞于G2/M期。表3藤黄菌素作用2 h对HL60细胞细胞周期的影响藤黄菌素(略)注：n=3，各组与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01。

　　3　讨论

　　黄酮类化合物有多种生理功能：调节毛细血管的脆性与渗透性；是一种有效的自由基清除剂，其作用仅次于维生素E；具有金属螯合的能力，可影响酶与膜的活性；对维生素C有增效作用；似乎有稳定人体组织内维生素C的作用。具有抑制细菌和抗生素的作用，这种作用使普通食物抵抗传染病的能力相当高；在两方面表现有抗癌作用，一方面是对恶性细胞的抑制（即停止或抑制细胞的增长），另一方面是从生化方面保护细胞免受致癌物的损害。已有的研究表明，多种黄酮类化合物能够抑制白血病细胞的增殖、影响其细胞周期的分布或诱导白血病细胞的凋亡。研究发现［1］：槲皮素能够抑制人白血病细胞株HMC1、MOLT4以及HL60细胞的增殖。其中槲皮素对HL60细胞生长的抑制作用呈现剂量依赖性。其作用96 h的IC50值为7.7 μmol/L；流式细胞仪检测显示槲皮素能引起HL60细胞G2/M期的比例升高，G0/G1期的比例降低，也呈剂量依赖性，这些作用在除去槲皮素后可得到逆转。此外，甘草查尔酮A也能够抑制HL60细胞的增殖，并能加强长春新碱的作用。另外，Wang等发现：槲皮素、芹黄素和杨梅黄酮都可以通过刺激caspase3和caspase9的活性诱导HL60细胞的凋亡，其作用的强弱依次为芹黄素＞槲皮素＞杨梅黄酮［1］。

　　由于藤黄菌素含有多个酚羟基且具有较强的抗氧化作用，其在细胞内也可还原MTT从而干扰显色反应，本实验选择台盘蓝拒染法作为细胞增殖的检测方法。结果发现藤黄菌素能显著地抑制HL60细胞的体外增殖，并呈明显的剂量关系和时间效应关系。从时效关系来看，对HL60细胞最显著的抑制时间是加药后的18 h；从量效关系来看，最明显的有效浓度为80 μmol/L；从不同时间IC50值的变化来看，藤黄菌素IC50值的变化幅度（90.49 μmol/L～16.19 μmol/L）较大，揭示藤黄菌素的抑制效果较强。另外，流式细胞术的结果表明：藤黄菌素作用2 h可使HL60细胞的细胞周期阻滞于G2/M期。由于细胞的增殖同细胞周期密切相关，提示藤黄菌素抑制HL60细胞的细胞增殖原因可能是通过抑制细胞G2/M期的DNA合成，延迟细胞周期的进程，进而抑制了细胞的增殖，最终导致细胞周期阻滞。此外，有研究表明藤黄菌素是细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)和细胞周期依赖性蛋白激酶1(CDK1)的特异性抑制剂［3，4］，而这些激酶是细胞周期进程中必不可少的一些关键酶，这提示了藤黄菌素所诱导的HL60细胞细胞周期的阻滞可能与CDK2和CDK1的活性受抑有关。其具体机制有待进一步研究。

　　:

　　［1］黄华艺,查锡良.黄酮类化合物抗肿瘤作用研究进展［J］.新药与临床杂志,2002,21(7):428433.

　　［2］孙文基,绳金房.天然活性成分简明手册［M］.第1版.北京:中国医药科技出版社,1998：6465.

　　［3］Brusselmans K,Vrolix R,Verhoeven G,et al.Induction of cancer cell apoptosis by flavonoids is associated with their ability to inhibit fatty acid synthase activity［J］.J Biol Chem,2005,280(7):56365645.

　　［4］Casagrande F,Darbon JM.Effects of structurally related flavonoids on cell cycle progression of human melanoma cells:regulation of cyclindependent kinases CDK2 and CDK1［J］.Biochem Pharmacol,2001,61(10):12051215.