脂肪源间充质干细胞治疗aGVHD分子机制的初步研究

                    作者：房佰俊，宋永平，林德，曹莹'

【关键词】  间充质干细胞；TCR,Vβ基因；移植物抗宿主病；脂肪

　　［摘要］ 目的：初步探讨成人脂肪源间充质干细胞(adult adipose tissuederived mesenchymal stem cells,AMSC)急性移植物抗宿主病(acute graftversushost disease，aGVHD)的分子机制。方法：3例行异基因造血干细胞移植术后发生 aGVHD患者，以每公斤体重2×106个细胞剂量静脉输注AMSC；应用RTPCR扩增患者AMSC使用前后外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族的CDR3，了解患者TCR VβT细胞的分布情况。结果：患者发生aGVHD时，有TCR Vβ3及其他亚家族基因表达，输注AMSC后，GVHD得以有效控制，Vβ3不表达；当患者GVHD复发时，Vβ3基因又表达，治疗后不表达。结论：AMSC治疗aGVHD的分子机制可能与其抑制TCR Vβ亚家族基因表达有关，TCR Vβ3可能是AMSC作用的靶基因。

　　［关键词］ 间充质干细胞；TCR Vβ基因；移植物抗宿主病；脂肪

　　Study on the Molecular Mechanism of Treatment with Adult Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells on Acute GraftVersusHost Disease

　　Abstract:Objective To investigate the molecular mechanism of treatment with adult adipose tissuederived mesenchymal stem cells (AMSC) on acute graftversushost disease (aGVHD)patients.Methods A dose of 2×106 AMSC per kg of the aGVHD patients' weight was given intravenously.The distribution of TCR VβT repertoire was determined with amplification of the CDR3 of TCR Vβ 24 subfamily genes by using RTPCR in 3 cases with GVHD following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.Results It was found that they were expressions of TCR Vβ3 gene and other subfamily genes when GVHD was obvious,but they were not detected after AMSC treatment with remission of GVHD,while during relapse of the GVHD,expressions of Vβ3 gene reappeared,but disappeared after treatment.Conclusion The molecular mechanism for the treatment with AMSC on GVHD might be correlated with the inhibition of TCR Vβ subfamily gene expressions and the TCR Vβ3 gene might be the target gene for AMSC.

　　Key words:Mesenchymal stem cell;TCR Vβ gene;GVHD;Adipose

　　严重的急性移植物抗宿主病是接受异基因造血干细胞移植术后患者最主要的致死原因之一。2006年5月Ringden等的报道指出，骨髓间充质干细胞能有效控制常规免疫抑制疗法无效之严重aGVHD［1］。最近,我们从成人脂肪组织中分离出一免疫表型为Flk1+CD31CD34的细胞亚群，体外实验证明其具有骨髓间充质干细胞的全部特性［2］故将其定义为成人脂肪源间充质干细胞(adult adipose tissuederived mesenchymal stem cells,AMSC)。本研究中，我们使用AMSC治疗3例aGVHD患者，获得良好疗效，并利用基因扫描技术分析了这3例患者在AMSC使用前后TCR Vβ基因的变化，初步探讨了间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)在体内控制aGVHD的分子机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　AMSC的分离和培养［2］　参照我们实验室已建立方法：抽取适量皮下脂肪组织，剪碎，用DHanks液洗去血细胞，0.2% Ⅱ型胶原酶消化2 h，洗掉胶原酶，用FicollPaque(1.077 g/ml)分离液分离得到单个核细胞后，用CD45及GlyA磁珠(Miltenyi Biotec)分别去除CD45+及GlyA+细胞，将阴性选择所得细胞接种在96孔细胞培养板中(每孔1个细胞)，96孔板预先以ECM胶［含5 ng/ml BMP4(Sigma),30 ng/ml SCF(Sigma)及3% FCS(Gibco)］铺板。20 d后，挑取单克隆细胞，扩增备用。扩增培养液成分为：40% MCDB(Gibco)，56% DF12(Gibco)，4% FCS(Gibco)，20 ng/ml IL6(Sigma)。

　　1.2　病例　病例1，女性，43岁，确诊慢性粒细胞白血病(慢性期)1 a后行同胞间HLA全相合外周造血干细胞移植,aGVHD预防按常规方法进行，即环胞霉素A(CsA，3 mg/kg/d，-5 d起)+甲鞍蝶呤［MTX，15 mg/m2，移植后第１天(+1 d)；10 mg/m2，+3 d，+6 d，+11 d］。+7 d患者出现腹部绞痛难忍、腹泻，给予解痉药治疗无效，结肠镜活检结果提示ⅣaGVHD，给予甲基强的松龙120 mg/d，未见缓解；+12 d，患者前胸及后背出现红色斑丘疹；分别在+18 d、+26 d给予赛尼哌(daclizumab，1 mg/kg)两次，效果不明显，患者病情呈进行性。+34 d，以每公斤体重2×106的剂量给予患者静脉输注同一造血干细胞供者的AMSC，2 d后胃肠道症状缓解，1周内皮疹消退。+72 d，患者又出现胃肠道症状，全身皮肤粗糙、痒，四肢及面部斑丘疹明显，并伴有食欲明显减退，又以每公斤体重2×106的剂量给予患者静脉输注同一造血干细胞供者的AMSC，1周内皮疹消退，消化道症状明显改善，此后病情稳定。病例2，男性，23岁，急性髓系白血病患者，在首次完全缓解基础上行同胞间HLA全相合外周造血干细胞移植。移植后+92 d，出现消化道ⅣⅤ aGVHD，在甲基强的松龙、FK506及赛尼哌等使用无效情况下，+121 d给予AMSC(2×106/kg)一次，1周后腹泻腹痛症状完全消退。病例3，男性，35岁，急性髓系白血病患者，在第二次完全缓解基础上行同胞间HLA全相合外周造血干细胞移植，移植后+49 d发生Ⅳ肝脏aGVHD，在甲基强的松龙、FK506及赛尼哌等治疗无效情况下，+75 d给予AMSC(2×106/kg)一次，1周后病情明显缓解，两周后肝功能异常指标全部恢复正常。

　　1.3　RNA提取及cDNA合成　3例患者在发生aGVHD后，分别在AMSC治疗前后，分离其外周血单个核细胞，应用TRIzol试剂盒(Gibco)按常规方法提取RNA，以随机引物和反转录酶(superscript Ⅱ)试剂盒(Gibco)合成cDNA第一链，以β2微球蛋白基因作为内参照。

　　1.4　反转录多聚酶链反应(RTPCR)　根据Vβ24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设Cβ下游引物，引物由上海生工生物公司合成。每一标本均分别以Vβ124/Cβ24对引物各进行24次PCR检测。PCR操作按依［3］进行。总反应体积为25 μl，其中含1 μl cDNA，0.1 mmol/L dNTP(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，引物浓度为0.5 μmol/L(任一Vβ引物和Cβ引物)，2 U聚合酶，反应在PCR缓冲液(1 mmol/L TrisHCL，pH 8.3 5 mmol/LKCL，1.5 mmol/L MgC12及0.001%明胶)(试剂为上海生工和Gibco产品)中进行，共进行40个循环，94 ℃ 1 min(首次3 min)，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min(末次10 min)，结束后保存于4 ℃中。各反应均设阳性和阴性对照。引物序列如下：Vβ1：5'CCG CAC AAC AGT TCC CTG ACT TGC3';Vβ2:5'GCC ACA TAC TAG CAA GGC GTC GA3';Vβ3： 5'CGC TTC TCC CGC ATT CTG GAG TCC3';Vβ4：5'TTC CCA TCA GCC GCC CAA ACC TAA3';Vβ5：5'CTC TGA GCT GAG CTG AAT GTG AAC GC3';Vβ6：5'TCT CAG GTG TGA TCC AAA TTC GGG3';Vβ7：5'CCT GAA TGC CCC AAC AGC TCT CTC3';Vβ8：5'CCT GAT GCG GGC TGG AGT TGC3';Vβ9：5'TTC CCT GGA GCT TGG TGA CTC TGC3';Vβ10：5'CCA CGG AGT CAG GGA CAC AGC AC3';Vβ11：5'TGC CAG CCC TCA CAT ACC TCT CA3';Vβ12：5'TGT CAC CAG ACT GGG AAC CAC CAC3';Vβ13：5'CAC TGC GGT GTA CCC AGG ATA TGA3';Vβ14：5'GGG CTC GGC TTA AGG CAG ACC TAC3';Vβ15：5'CAG GCA CAG GCT AAA TTC TCC CTG3';Vβ16：5'GCC TGC AGA ACT GGA GGA TTC TGG3';Vβ17：5'CTG CTG AAT TTC CCA AAG AGG GCC3';Vβ18：5'TGC CCC AGA ATC TCT CAG CCT CCA3';Vβ19：5'TCC TCT CAC TGT GAC ATC GGC CCA3';Vβ20：5'AGC TCT GAG GTG CCC CAG AAT CTC3';Vβ21：5'TCC AAC CTG CAA GGC TTG ACG ACT3';Vβ22：5'AAG TGA TCT TGC GCT GTG TCC CCA3';Vβ23：5'GCA GGG TCC AGG TCA GGA CCC CA3';Vβ24：5'CCC AGT TTG GAA AGC CAG TGA CCC3';Cβ：5'CGG GCT GCT CCT TGA GGG GCT GCG3'。

　　2　结果

　　病例1，发生aGVHD时，TCR Vβ基因分析发现，患者外周血单个核细胞表达TCR Vβ2、3、8、13、14及15；当消化道症状缓解，皮疹消退时，TCR Vβ基因分析显示 Vβ3及上述基因均不表达。+69 d患者病情反复时，TCR Vβ3和Vβ8又表达，再予AMSC后病情稳定，Vβ3基因不表达，但有Vβ8、9、13、14及15表达。病例2，发生aGVHD时，TCR Vβ基因分析可见Vβ3、2、5、7、8、13、14、15、16、19、20、21、22、23表达；给予AMSC后，aGVHD得以有效控制，TCR Vβ基因分析发现Vβ3不表达，但有Vβ2、8、9、13、14及15表达。病例3，发生aGVHD时，TCR Vβ基因分析可见Vβ2、3、5、7、8、13、14、15、16、19、20、21、22、23表达；给予AMSC后，aGVHD症状消失，TCR Vβ基因分析发现Vβ3不表达，但有Vβ2、5、13、14及15表达。

　　3　讨论

　　异基因造血干细胞移植是治疗多种恶性血液系统肿瘤的一有效手段，但其主要并发症即移植物抗宿主病却是严重影响患者长期生存和生活质量的重要因素。尽管CsA联合短程MTX或(和)固醇类激素是预防aGVHD的经典方案，但使用该方案后aGVHD的发生率及死亡率仍较高。如在供受者间HLA全相合的非血源异基因造血干细胞移植中，急性Ⅱ度~Ⅳ度aGVHD的发生率可达78%，Ⅲ度~Ⅳ度急性aGVHD发生率为36%，而慢性aGVHD发生率为64%。对于发生aGVHD的患者，增大CsA剂量，其对肝肾的毒性亦明显增强；固醇类激素大剂量应用，易诱发严重感染及继发糖尿病；另外，赛尼哌(抗Tac单抗)等新型免疫抑制剂价格昂贵，不能为大部分患者接受。因此，对大部分患者，寻找新的高效低毒的免疫抑制剂已成为当务之急。大量的研究已经证实，MSC在体内外具有显著的免疫调节作用，能有效预防、控制aGVHD的发生、，其作用机制以往多集中于抑制同种抗原刺激的T淋巴细胞或B淋巴细胞的增殖以及T细胞亚群的改变［1,4～10］。免疫学界多数学者认为aGVHD与不同TCR Vβ亚家族的克隆性T细胞的异常表达有关,但至今仍未有比较确切的证据。国内的李扬秋等曾报道慢性aGVHD患者持续存在一些克隆性增殖的TCRVβ亚家族T细胞［11］,提示aGVHD 与某些TCR Vβ亚家族有关,但由于所研究病例数较少,尚未见明确的性。本文结果首次提示，成人脂肪源间充质干细胞能有效控制aGVHD，其作用的分子机制可能与抑制TCR Vβ亚家族基因表达有关,具体体现在当患者发生aGVHD时，有TCR Vβ3以及其他亚家族基因表达，AMSC治疗后，aGVHD得以缓解，Vβ3基因不表达；当患者aGVHD复发时，Vβ3基因又表达，治疗后再次消失。本文结果表明，AMSC可能通过影响TCR Vβ3基因的表达而抑制T细胞功能，发挥抗aGVHD作用，但这一结果有待于积累更多临床数据加以证实。

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