不同条件下保存样本对血清C
【关键词】 C
［摘要］ 目的：观察在不同温度时间条件下保存血清样本对C反应蛋白(CRP)测定值的影响。方法：提取29例感染患者的血清标本，分装后放置在室温4 ℃和-20 ℃条件下；采用固相夹心胶体金法分别测定室温和4 ℃标本在1周、2周、3周、4周各时间点的CRP值，测定4周后-20 ℃冷藏标本的CRP值；将各测定值与血清分装后的即时检测值作比较，观察CRP的变化。结果：本组患者血清中含有中高浓度的CRP(54.7±53.1)mg/L，血清标本在-20 ℃条件下保存4周CRP能保持稳定，CRP检测值无明显变化；在室温或4 ℃条件下，中低浓度(CRP＜50 mg/L)标本能保持相对稳定1周～4周；高浓度标本(CRP≥50 mg/L)在1周～2周后CRP测定值出现一定程度升高，但升高程度不大(均值升高13.3％～22.6％)。结论：CRP是十分稳定的蛋白质分子，在室温或4 ℃保存血清标本1周～4周，其检测值仍具有价值；在-20 ℃条件下保存血清，可以保持CRP的稳定。
［关键词］ C反应蛋白；测定；胶体金法
The Leverage of Different Storage Conditions on Creactive Protein Determination A Preliminary Study
Abstract：Objective To observe the leverage of different storage conditions on Creactive protein determination.Methods The serum of 29 patients suffering infectious disease were obtained and storedatroom temperature,4 ℃ for 1 to 4 weeks，and -20 ℃ for 4 weeks.CRP is determined with solid phase sandwich colloidal gold method.Room and 4 ℃ samples were measured after 1 week,2 weeks,3 weeks and 4 weeks，-20 ℃ samples after 4 weeks.And those CRP values were compared with that of instantdetermined samples.Results The patients had relatively medium to high CRP values of (54.7±53.1)mg/L.CRP could remain stable under -20℃ storage for 4 weeks.Samples of medium CRP value(＜50 mg/L)could retain relatively stable.While samples with higher CRP(≥50 mg/L)concentration heightened,but the changes were not very large(median CRP increased by 13.3～22.6％ of original value).Conclusion CRP is a kind of protein molecule of pretty stable.The CRP determination is still valuable even if sample was stored at room temperature or 4 ℃ for 1 to 4 weeks.But to maintain absolute stable，serum samples have to be kept under -20 ℃ condition.
Key words：Creactive protein；Determination；Colloidal gold method
在感染、创伤、组织坏死、自身免疫性疾病等因素刺激下，C反应蛋白(Creactive protein,CRP)均可以作为可靠的全身或局部炎症反应指数；又因其测定方法简单、快速，使CRP成为临床中最为常用的急性期蛋白指标。本实验旨在观察在不同温度-时间条件下保存血清样本对CRP测定值的影响。
1 材料和方法
1．1 患者和标本采集 采集29例在我院住院患者的空腹或随机血标本。其中男性16例，女性13例，中位年龄26岁；分别罹患急性泌尿系统感染16例、呼吸道感染8例和其他感染性疾病5例。
1．2 血标本分装 使用8 ml真空干燥试管(无抗凝剂)采静脉血4 ml×1支，在室温下静置1 h~2 h，待血清析出，2 500 rmp×5 min离心后，提取血清，并以每份100 μl将血清分装入10支1.5 ml干燥塑料离心管(带盖，江苏康健)中。
1．3 血标本保存 分装后即取1份血清标本测定CRP值；将8份标本分别放置在室温(4支，20±7℃)和4 ℃(4支，Panasonic NRC28WU1冰箱)条件下，分别保存1周、2周、3周和4周；将1份标本放置在-20 ℃(同一冰箱)条件下保存4周。在1周、2周、3周、4周等相应时间点，各取出1份室温和4 ℃标本检测CRP浓度，在4周后测定-20 ℃条件下保存标本的CRP值。
1．4 CRP检测 标本CRP采用固相夹心胶体金法测定(专用CRP检测卡、相关试剂和NycoCard Reader II全定量特种蛋白金标检测仪，由挪威AxisShield公司生产)：按照产品说明书，取5 μl血清标本经0.4 ml稀释液稀释后，将50 μl稀释后样本加于测定卡片的圆孔中，标本经渗透作用流过反应膜时，CRP分子即被固定于膜上的CRP特异性单克隆抗体所捕获，CRP将和随后加入的胶体金抗体结合物相结合，发生双抗体夹心反应。用一滴洗涤液将膜上未结合的金标抗体洗涤清除。标本中CRP达到或超过最低检测(≥5 mg/L)水平时，膜上出现紫红色，颜色强度和CRP浓度比例正相关，使用NycoCard Reader II金标定量仪定量测定CRP值。如标本CRP在常规检测浓度范围外(5 mg～150 mg)，则减半(0.2 ml)或增倍(0.8 ml)稀释液量，以得出测定结果。
1．5 统计学处理 实验结果以±SD表示，两组间比较采用Student配对t检验，以双侧P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2．1 29份血清标本CRP即时检测结果(S0) CRP值(54.7±53.1)mg/L(CRP范围6 mg/L～264 mg/L)。
2．2 标本在-20 ℃条件下保存4周CRP检测结果 所有血清标本在-20 ℃条件下保存4周，CRP测定值(S-20 ℃)(57.2±53.2)mg/L与即时检测(S0)具有良好的相关性(r=0.94)，检测值差异无显著性(P=0.89)(见表1)。表明，血清标本保存在-20 ℃冰箱，4周后检测值无明显变化。
表1 全部标本不同条件下CRP测定值及与S0相比P值和均值升高比率（略）
注：*与S0相比，P＜0.05；S0：CRP即时检测值；RS1w、2w：在室温下保存血清1、2周；4S1w、2w：4 ℃下保存血清1、2周；S20 ℃：-20 ℃条件下保存血清4周。
2．2 室温及4 ℃条件下放置标本1周～4周CRP检测结果
2．2．1 在室温或4 ℃条件下标本，部分标本测定值变化较大，1周～4周总体CRP均值升高(见表1)，与S0差异有显著性。
2．2．2 分层分析表明，含有中低CRP浓度(S0＜50 mg/L)的血清标本(n＝15)，无论在室温、4 ℃或-20 ℃条件下保存CRP测定值变化幅度较小，CRP测定值与S0差异无显著性(见表2)。含有较高CRP浓度(S0≥50 mg/L)的血清标本(n＝14)，除冷藏保存(-20 ℃)标本的CRP与S0相比无显著变化外，在室温或4℃条件放置样本，1周～2周后CRP均值均有所升高，且多与S0差异有显著性(见表2)。
3 讨论
CRP主要在IL6［1］刺激下，由肝细胞合成；IL1β、TNFα等炎症因子亦对CRP分泌有调节作用。在机体炎症状态的早期(6 h内)，血清CRP就开始升高，每8 h提高1倍，约在50 h左右达到峰值水平［2］。正常人血CRP在0.08 mg/L～3.11 mg/L(2.5%～97.5%)之间，无性别差异；年龄对CRP水平有一定影响,但相对较弱［3］。在强烈炎症因素刺激下，CRP可升高至基线水平的1 000倍。通过监测血清CRP可以有助于评价疾病状态和疗效。CRP是由5个相同的单体，通过非共价键围绕拼接，组成盘状(近似二维结构)的五聚体分子，分子量约为120 kPa。CRP每个单体的识别面(Recognition face)和效应面(Effector face)各具备不同的配体结合位点。识别面含磷酸胆碱(许多细菌的细胞壁含有该成分)结合区，它由两个相互配合的钙离子和临近的疏水袋(Hydrophobic pocket)构成。效应面存在与补体分子C1q、免疫球蛋白IgGFcγR受体等分子结合的配体。使CRP得以发挥中和、激活补体、调理等非特异免疫防护作用［3］。CRP在体内确切的代谢清除过程尚不清楚。人体血浆CRP的清除半衰期约为19 h，血浆CRP水平取决于肝脏的合成速率，而血浆CRP浓度高低对CRP的清除速度不造成影响［4］。体外实验显示，通过加热、蛋白酶水解(如中性粒细胞表面和中性粒细胞溶酶体中所含有的酶类)和其他方法可以使CRP五聚体分裂成大小不等的片断［5，6］；添加Ca2＋可以明显增加CRP分子的稳定性，从而可能抵抗加热或盐析引起的CRP变性、分解以及与其他蛋白分子凝聚结合［5，7］。CRP的裂解片断可能失去母体分子的抗原性,亦可能保持母体分子的抗原特征；CRP裂解片断是否能与检测单克隆抗体结合取决于其是否含有相应单抗的结合表位［8］。Aziz N等［9］使用免疫比浊法测定数组血清和血浆标本时发现CRP分子极为稳定。在室温(20 ℃~25 ℃)、4 ℃条件下保存血清标本3周，与-70 ℃条件下保存的血清样本(n＝17)，CRP测定值差异无显著性(均值分别为4.72 mg/L、4.71 mg/L和5.04 mg/L)。在-70 ℃条件下的冷藏标本(n＝15)，经过3个～7个冻融周期，CRP检测值差异无显著性。但该实验所测定标本的CRP浓度较低，均值浓度为2.74 mg/L～5.04 mg/L。
表2 不同CRP浓度标本不同条件下CRP测定值及与S0相比P值和均值升高比率（略）
注：*与S0相比，P＜0.05；RS3w、4w：在室温下保存血清标本3周、4周；4S3w、4w：4 ℃下保存血清标本3周、4周。
本实验采用较为敏感、快速和稳定的固相夹心胶体金法测定血清CRP。结果表明：含有中高浓度(CRP＞5 mg/L)CRP的血清标本，在-20 ℃下可以保持稳定至少4周。也证实，即使在室温或4 ℃条件下放置，对于含中等浓度(＜50 mg/L)CRP的血清标本，无需特殊处理CRP测定值基本可以保持稳定长达1周～4周。但对于高浓度(CRP≥50 mg/L)样本，除非-20 ℃以上冷藏保存，在室温或4 ℃条件下保存，CRP测定值将有不同程度的升高(均值升高13.3%～22.6％，P＜0.05)。由于无论是室温或4 ℃标本，CRP均值并无随保存时间的延长，CRP逐渐升高的趋势(见表1、表2)；所以不支持因血清标本水分蒸发导致标本浓缩，造成的检测值升高的假设。笔者发现，在室温下放置1周以上时，血清标本黏滞度明显减低、颜色变淡，提示血浆蛋白成分分解，但CRP分子缘何能保持长期稳定，推测可能与以下因素相关：血清中存在钙离子，使CRP分子结构处于最稳定的状态；CRP的5个单体间由非共价键相连接，使单体之间结合相对牢固〔如对酶稳定的分泌型IgA二聚体，为其提供保护的分泌片(Secretory piece)亦经非共价键与IgA结合，使之不易被蛋白酶水解〕。但高CRP浓度标本(≥50 mg/L)在放置一定时间后缘何CRP测定值会出现升高，考虑至少有以下可能性：高浓度血清样本中所含WBC较高(CRP越高、感染越重，血WBC/中性粒细胞计数可能越高)，白细胞表面或溶酶体中含有的蛋白酶造成CRP分子分解，分解后的CRP片断保持了部分母体分子的抗原表位，可能使测定值升高；由于本试验CRP检验方法学的局限性造成。上述疑问有待进一步采用高精度测定方法(如ELISA、蛋白电泳)检测、验证，但结合Aziz N等人［9］和本试验的结果可以看出，CRP是十分稳定的蛋白质分子，即使在常规条件下保存(室温或4 ℃)，CRP测定值均能保持相对稳定，不会出现过大(超过原检测值的25％以上)的变化；因而即使在常规条件下保存1周～4周，血清CRP的检验值仍具有一定价值。作为临床常用检验指标，结合本试验和相关研究结果，笔者建议在进行CRP检验时宜尽量减少标本存放时间；如无法即时检测，在室温或4℃条件下短期放置血清标本，其检验值仍具有一定参考意义；如标本需要集中测定时，可将待测血清放置在-20 ℃冰箱保存至少4周。
参考：
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