二氮嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

                    作者：沈诚，范士志，陈建明，李志平，李寒   

【摘要】  目的研究二氮嗪(DZ)开放线粒体ATP敏感性钾通道对缺血再灌注损伤所致大鼠心肌组织ICAM-1和TNF- α表达的影响。方法采用离体工作心脏灌注模型,大鼠随机分为正常对照组，缺血再灌注组，DZ组, DZ抑制剂-格列苯脲组。采用RT-PCR法测定心肌ICAM-1mRNA表达,ELISA检测试剂盒检测TNF- α蛋白含量。结果与正常对照组相比, 心肌组织ICAM-1表达和TNF- α含量在缺血再灌注后有显著性增加(P<0.01)。DZ处理后, ICAM-1表达和TNF- α含量与缺血再灌注组相比有明显下降(P<0.05); 格列苯脲组ICAM-1表达和TNF- α含量明显高于DZ治疗组(P<0.05)。结论心肌缺血再灌注损伤使ICAM-1和TNF- α表达明显升高, 二氮嗪(DZ)开放线粒体ATP敏感性钾通道可下调心肌组织ICAM-1和TNF- α的表达,这可能有助于减轻缺血再灌注所致心肌损伤。
　　

【关键词】  ATP敏感性钾通道；缺血再灌注； ICAM-1； TNF- α

　　The Effect of Diazoxide on Ischemia-Reperfusion Injury in Rat  Cardiac Muscles

　　Abstract: OBJECTIVE To investigate the effect of diazoxide on expression of ICAM-1 and TNF- α during ischemia-reperfusion in rat cardiac muscles. METHODS Using isolated rat heart model, 40 male SD rats were randomly divided into normal control group(n=10), ischemia-reperfusion group(n=10), diazoxide treatment group(n=10)and diazoxide inhibitor group(n=10).The expression of ICAM-1mRNA  was extracted and measured by RT-PCR. TNFα level in the myocardium were measured using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) system.  RESULTSThe expression of ICAM-1mRNA significantly increased after ischemia-reperfusion and TNF- α levels had the same change. treatment with diazoxide significantly inhibited the expression of ICAM-1mRNA, and concomitantly decreased the level of  TNF- α in the myocardium. The diazoxide inhibitor can significantly increase the expression of ICAM-1mRNA and the level of TNF- α. CONCLUSIONThese data suggest that myocardial ischemia-reperfusion can result in intensive activation of ICAM-1 and TNF- α. Early treatment with diazoxide might be benefit for attenuation of myocardial injury induced by ischemia-reperfusion.

　　Key words：KATP; Ischemia-reperfusion; ICAM-1; TNF- α

　　心肌缺血再灌注损伤是阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要原因。近年发现,肿瘤坏死因子(TNF- α)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)参与了心肌缺血再灌注损伤的发生,其作用越来越受到重视。心肌ATP敏感钾离子通道（ATP-sensitive potassium channel  KATP）是心肌细胞内一种可被细胞内ATP和其他腺嘌呤核苷酸抑制的内向整流K+通道，可调节正常心肌细胞线粒体结构和功能。缺血再灌注损伤中，线粒体KATP与TNF- α和ICAM-1表达关系的研究目前尚为缺乏。本文采用离体大鼠心脏灌注模型,通过研究开放线粒体KATP对缺血再灌注损伤心肌TNF- α和ICAM-1表达的影响,探讨减少心肌缺血再灌注损伤的有效途径。

　　1材料与方法 

　　1.1动物分组

　　40只雄性清洁级SD大鼠,体重200 ｇ～250 ｇ,随机分为4组。A组，即正常对照组(10只),麻醉后切开胸腔取正常心肌；B组，即缺血再灌注组(10只), 取心脏，建立离体灌注模型；Krebs-Henseleit缓冲液预灌注15 min，待心脏稳定搏动后，给予常规含钾停搏液灌注，33℃停灌30min，复灌30 min；C组，即二氮嗪治疗组(DZ组,10只), 取心脏，建立离体灌注模型；待心脏稳定搏动后，给予常规含钾停搏液+ DZ灌注，33℃停灌30min，复灌30 min。D组，即二氮嗪抑制剂——格列苯脲组(格列苯脲组,10只), 取心脏，建立离体灌注模型；待心脏稳定搏动后，给予常规含钾停搏液+ 格列苯脲灌注，33℃停灌30 min，复灌30 min。

　　1.2离体工作心脏灌注模型

　　动物充分麻醉后，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，按3 mg/Kg经下腔静脉注射肝素生理盐水。1 min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉至无名动脉远端，并剪断，迅速将其余大血管一并结扎并剪断，取出心脏，置于4℃K-H液中简单修剪。开启离体心脏灌注系统，流量约15 ml/min。显微器械提起主动脉，将灌注管道插入，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，打结固定，开始灌注，心脏迅速恢复搏动。在肺动脉圆锥处剪一小口，使冠脉流出液流出。剪开左心耳，将左心室测压管经切口、左心房、二尖瓣插入，并将另一连于灌输瓶的灌注管插入左心房，打结固定。连接各测压管道并调零，开始测压。调整离体心脏灌注系统转速及流量，使主动脉根部压力约80 cmH2O，而灌注瓶与左心房落差约20 cm，相当于左心室前负荷为20 cmH2O，后负荷为80 mm Hg。心脏持续稳定搏动。待心脏稳定搏动15 min后，关闭灌注系统，心脏逐渐停搏。心肌缺血30 min。重新开启关注系统，心脏迅速恢复搏动，起初心率较慢，搏动不稳定，2 min～3 min后逐渐恢复。

　　检测指标及方法　(1)采用RT-PCR法检测ICAM-1mRNA表达：秤取心肌组织约150 mg ，以异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。采用RT-PCR技术对转录产物进行扩增,以β-actin作为内参对照。大鼠ICAM-1序列(扩增片段为590 bp):5, -AGGTGTGATATCCGGTAGA -3,(上游)；5, - CCTTCTAAGTGGTTGGAACA -3,(下游); β-actin序列 (扩增片段为180 bp):5, -ATCGTGCGGGACATCAAGG -3,(上游);5, - CAGGAAGGAGGGCTGGAACA -3,(下游)。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,电泳凝胶置于GDS8000凝胶成像系统，PCR产物量以光密度×面积表示。记录各条带积分光密度(IOD)，将检测基因与自身β-actin条带IOD相比较得到其相对IOD。(2)心肌组织中TNF-α含量测定(ELISA):取0.05g的心肌组织,用磷酸盐缓冲液(PH7.4)在4℃条件下匀浆,再离心20 min,转速1 200 rpm,取上清液用于TNF-α测定,根据试剂盒中提供的步聚操作,测出TNF-α的浓度。

　　1.3统计学处理

　　各项均数±标准差( ±s )表示,并用SPSS软件行单因素方差分析和t检验,P<0.05表明差异有显著性。

　　2结果

　　2.1各组心肌ICAM-1表达的变化

　　A组正常心肌组织ICAM-1的表达均较微弱；而缺血再灌注后B组可见到ICAM-1表达较A组显著增高（P<0.01 ）。C组给予DZ处理心肌ICAM-1含量较B组也有明显降低（P<0.05），但仍明显高于正常，D组ICAM-1含量明显高于C组（P<0.05），但仍低于B组（P<0.05），见表1。

　　2.2各组心肌TNF-α含量变化

　　A组正常心肌TNF-α含量较低，缺血再灌注后B组TNF-α含量则明显增高，与A组比较有显著性差异（P<0.01）。C组给予DZ处理心肌TNF-α含量虽然仍明显高于正常，但较B组也有明显降低（P<0.05），相反D组TNF-α含量与B组无显著差异，明显高于C组（P<0.05），见表1。表1大鼠心肌组织ICAM-1表达和TNF-α含量（略）注：与正常对照组（A组）比较 ：*P<0.01；与缺血再灌注组（B组）比较：△P<0.05；
与二氮嗪组（C组）比较 ：* *P<0.05

　　3讨论

　　线粒体KATP是包括一个55KDa内向K+通道和一个63KDa磺脲类受体异源多聚体，当线粒体基质ATP不足时,此通道开放,线粒体产生内向K+电流,线粒体基质体积短时增大,呼吸链活性显著增强。二氮嗪是线粒体KATP通道的特异性开放剂，对线粒体上的KATP作用强大而对胞膜的KATP作用相对较弱。Marina等［1］以离体小鼠心脏实验,缺血25min再灌注30min，发现二氮嗪能推迟心脏挛缩的开始,促进缺血后功能恢复。Beresewicz等［2］证实以二氮嗪开放线粒体KATP对缺血心肌具有保护作用。同时亦有实验证实，心肌缺血预适应对心肌的保护也由线粒体KATP介导。TNF-α是一种自分泌的作用因子，在缺血再灌注损伤中参与了心肌损伤的形成和，其表达水平在缺血再灌注时增高，促进了白细胞与内皮细胞的粘附和相互作用，使粒细胞向缺血再灌注区域的浸润大大增加，从而导致心肌损害［3］。ICAM-1作为白细胞功能相关抗原、巨噬细胞分化抗原-1的配体,参与白细胞与血管内皮细胞的黏附并向血管外迁移,黏附心肌细胞释放细胞毒, 表达增强的ICAM-1还可反馈作用于内皮细胞、巨噬细胞，促进细胞因子的炎症介质的表达。ICAM-1在内皮及心肌细胞中的诱生对中性白细胞介导的缺血再灌注损伤至关重要［4］。国外研究发现, 心脏缺血再灌注损伤中ICAM-1表达明显升高, 且与心肌损伤密切相关［5］。本实验数据表明，缺血再灌注损伤模型中TNF-α, ICAM-1含量明显增加。二氮嗪治疗组下调心肌组织中TNF-α, ICAM-1水平,保护心肌。同时，应用格列苯脲可减少二氮嗪的这种保护作用。由此证明开放线粒体KATP通道可抑制心肌缺血再灌注时内皮细胞合成释放细胞因子等炎症介质，减轻心肌损伤。

　　总体来看，通过开放线粒体KATP而减少心肌TNF- α和ICAM-1表达能够减轻缺血再灌注损伤并有效防止心肌缺血再灌注引起的炎性反应。本实验结果为临床防止缺血再灌注损伤提供了一个新的思路,其确切临床价值有待于进一步的研究和证实。

【】
  　　［1］Marina-Prendes MG, Rastelli AH, Astudilla C, et al. Influence of fasting on the effects of diazoxide in the ischemic-reperfused rat heart［J］. J Physiol Biochem,2004,60(1): 51-58.

　　［2］Beresewicz A, Maczewski M, Duda M, et al. Effect of classic preconditioning and diazoxide on endothelial function and O2- and NO generation in the post-ischemic guinea-pig heart［J］. Cardiovasc Res,2004,63(1): 118-129.

　　［3］Sugano M, Hata T, Tsuchida K, et al. Local delivery of soluble TNF-alpha receptor 1 gene reduces infarct size following ischemia/reperfusion injury in rats［J］. Mol Cell Biochem,2004, 266(1-2): 127-132.

　　［4］Merchant SH, Gurule DM, Larson RS, et al. Amelioration of ischemia-reperfusion injury with cyclic peptide blockade of ICAM-1［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,284(4): H1260-1268.

　　［5］Yang XP, Irani K, Mattagajasingh S, et al. Signal Transducer and Activator of Transcription 3{alpha} and Specificity Protein 1 Interact to Upregulate Intercellular Adhesion Molecule-1 in Ischemic-Reperfused Myocardium and Vascular Endothelium［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,28(3):1-3.